Die Differentialdiagnose von mittels Computertomographie (CT) identifizierten Lungenknoten bleibt in der klinischen Praxis eine Herausforderung.Hier charakterisieren wir das globale Metabolom von 480 Serumproben, darunter gesunde Kontrollpersonen, gutartige Lungenknötchen und Lungenadenokarzinom im Stadium I.Adenokarzinome weisen einzigartige metabolische Profile auf, wohingegen gutartige Knötchen und gesunde Personen eine hohe Ähnlichkeit in den metabolischen Profilen aufweisen.In der Entdeckungsgruppe (n = 306) wurde eine Reihe von 27 Metaboliten identifiziert, die zur Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Knötchen dienen.Die AUC des Diskriminanzmodells in der internen Validierungsgruppe (n = 104) und der externen Validierungsgruppe (n = 111) betrug 0,915 bzw. 0,945.Die Pathway-Analyse ergab im Vergleich zu gutartigen Knötchen und gesunden Kontrollpersonen erhöhte glykolytische Metaboliten, die mit einem verminderten Tryptophan im Lungenadenokarzinomserum verbunden sind, und legte nahe, dass die Tryptophanaufnahme die Glykolyse in Lungenkrebszellen fördert.Unsere Studie unterstreicht den Wert von Serummetaboliten-Biomarkern bei der Beurteilung des Risikos von Lungenknötchen, die mittels CT erkannt werden.
Eine frühzeitige Diagnose ist entscheidend, um die Überlebensraten von Krebspatienten zu verbessern.Ergebnisse der US-amerikanischen National Lung Cancer Screening Trial (NLST) und der europäischen NELSON-Studie haben gezeigt, dass Screening mit niedrig dosierter Computertomographie (LDCT) die Lungenkrebsmortalität in Hochrisikogruppen deutlich senken kann1,2,3.Seit der weitverbreiteten Verwendung der LDCT zur Lungenkrebsvorsorge ist die Häufigkeit zufälliger radiologischer Befunde von asymptomatischen Lungenknötchen weiter gestiegen 4 .Lungenknötchen werden als fokale Trübungen mit einem Durchmesser von bis zu 3 cm definiert 5 .Wir haben Schwierigkeiten, die Wahrscheinlichkeit einer Malignität einzuschätzen und mit der großen Anzahl von Lungenknoten umzugehen, die zufällig bei der LDCT entdeckt wurden.Einschränkungen der CT können zu häufigen Nachuntersuchungen und falsch positiven Ergebnissen führen, was zu unnötigen Eingriffen und Überbehandlungen führt6.Daher besteht die Notwendigkeit, zuverlässige und nützliche Biomarker zu entwickeln, um Lungenkrebs im Frühstadium korrekt zu erkennen und die meisten gutartigen Knötchen bei der Ersterkennung zu unterscheiden 7 .
Eine umfassende molekulare Analyse von Blut (Serum, Plasma, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes), einschließlich Genomik, Proteomik oder DNA-Methylierung8,9,10, hat zu einem wachsenden Interesse an der Entdeckung diagnostischer Biomarker für Lungenkrebs geführt.Mittlerweile messen Metabolomics-Ansätze zelluläre Endprodukte, die durch endogene und exogene Vorgänge beeinflusst werden, und werden daher zur Vorhersage von Krankheitsbeginn und -ausgang eingesetzt.Die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) ist aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und ihres großen dynamischen Bereichs, der Metaboliten mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften abdecken kann, eine weit verbreitete Methode für Metabolomik-Studien11,12,13.Obwohl eine globale metabolische Analyse von Plasma/Serum verwendet wurde, um Biomarker zu identifizieren, die mit der Diagnose von Lungenkrebs14,15,16,17 und der Wirksamkeit der Behandlung in Zusammenhang stehen,18 müssen Serummetabolitenklassifikatoren zur Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Lungenknötchen noch umfassend untersucht werden.-massive Forschung.
Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom sind die beiden Hauptsubtypen des nichtkleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).Verschiedene CT-Screening-Tests weisen darauf hin, dass das Adenokarzinom die häufigste histologische Form von Lungenkrebs ist1,19,20,21.In dieser Studie verwendeten wir Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie und hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), um eine Metabolomik-Analyse an insgesamt 695 Serumproben durchzuführen, darunter gesunde Kontrollpersonen, gutartige Lungenknötchen und CT-erkannte ≤3 cm.Screening auf Lungenadenokarzinom im Stadium I.Wir haben eine Reihe von Serummetaboliten identifiziert, die Lungenadenokarzinome von gutartigen Knötchen und gesunden Kontrollpersonen unterscheiden.Die Signalweganreicherungsanalyse ergab, dass ein abnormaler Tryptophan- und Glukosestoffwechsel häufige Veränderungen bei Lungenadenokarzinomen im Vergleich zu gutartigen Knötchen und gesunden Kontrollpersonen sind.Schließlich haben wir einen Serum-Stoffwechselklassifikator mit hoher Spezifität und Sensitivität zur Unterscheidung zwischen bösartigen und gutartigen Lungenknoten, die durch LDCT erkannt wurden, erstellt und validiert, was bei der frühen Differentialdiagnose und Risikobewertung hilfreich sein kann.
In der aktuellen Studie wurden nach Geschlecht und Alter entsprechende Serumproben von 174 gesunden Kontrollpersonen, 292 Patienten mit gutartigen Lungenknoten und 229 Patienten mit Lungenadenokarzinom im Stadium I entnommen.Die demografischen Merkmale der 695 Probanden sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.
Wie in Abbildung 1a dargestellt, wurden im Sun Yat-sen University Cancer Center insgesamt 480 Serumproben, darunter 174 gesunde Kontrollproben (HC), 170 gutartige Knötchen (BN) und 136 Lungenadenokarzinomproben (LA) im Stadium I, entnommen.Entdeckungskohorte für ungezieltes metabolomisches Profiling mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS).Wie in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt, wurden unterschiedliche Metaboliten zwischen LA und HC, LA und BN identifiziert, um ein Klassifizierungsmodell zu erstellen und die Analyse der differenziellen Signalwege weiter zu untersuchen.104 vom Sun Yat-sen University Cancer Center entnommene Proben und 111 von zwei anderen Krankenhäusern entnommene Proben wurden einer internen bzw. externen Validierung unterzogen.
eine Studienpopulation in der Entdeckungskohorte, die einer globalen Serum-Metabolomik-Analyse mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS) unterzogen wurde.b Partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) des gesamten Metaboloms von 480 Serumproben aus der Studienkohorte, einschließlich gesunder Kontrollpersonen (HC, n = 174), gutartigen Knötchen (BN, n = 170) und Lungenadenokarzinom im Stadium I (Los Angeles, n = 136).+ESI, positiver Elektrospray-Ionisationsmodus, -ESI, negativer Elektrospray-Ionisationsmodus.c–e-Metaboliten mit signifikant unterschiedlichen Häufigkeiten in zwei gegebenen Gruppen (zweiseitiger Wilcoxon-Signed-Rang-Test, angepasster p-Wert der Falscherkennungsrate, FDR <0,05) werden in Rot (Fachänderung > 1,2) und Blau (Fachänderung < 0,83) angezeigt. .), dargestellt auf der Vulkangrafik.f Hierarchische Cluster-Heatmap, die signifikante Unterschiede in der Anzahl der annotierten Metaboliten zwischen LA und BN zeigt.Quelldaten werden in Form von Quelldatendateien bereitgestellt.
Das gesamte Serummetabolom von 174 HC, 170 BN und 136 LA in der Entdeckungsgruppe wurde mittels UPLC-HRMS-Analyse analysiert.Wir zeigen zunächst, dass sich Qualitätskontrollproben (QC) eng im Zentrum eines unbeaufsichtigten Hauptkomponentenanalysemodells (PCA) ansammeln, was die Stabilität der Leistung der aktuellen Studie bestätigt (ergänzende Abbildung 2).
Wie in der partiellen Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) in Abbildung 1 b gezeigt, stellten wir fest, dass es deutliche Unterschiede zwischen LA und BN, LA und HC im positiven (+ESI) und negativen (−ESI) Elektrospray-Ionisationsmodus gab .isoliert.Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen BN und HC unter +ESI- und -ESI-Bedingungen festgestellt.
Wir fanden 382 Differenzierungsmerkmale zwischen LA und HC, 231 Differenzierungsmerkmale zwischen LA und BN und 95 Differenzierungsmerkmale zwischen BN und HC (Wilcoxon-Signed-Rang-Test, FDR <0,05 und Mehrfachänderung >1,2 oder <0,83) (Abbildung .1c-e )..Die Peaks wurden anhand einer Datenbank (mzCloud/HMDB/Chemspider-Bibliothek) anhand des m/z-Werts, der Retentionszeit und der Fragmentierungs-Massenspektrumsuche weiter mit Anmerkungen versehen (Supplementary Data 3) (Einzelheiten im Abschnitt „Methoden“ beschrieben) 22 .Schließlich wurden 33 und 38 kommentierte Metaboliten mit signifikanten Unterschieden in der Häufigkeit für LA gegenüber BN (Abbildung 1f und Ergänzungstabelle 2) bzw. LA gegenüber HC (Ergänzungsabbildung 3 und Ergänzungstabelle 2) identifiziert.Im Gegensatz dazu wurden in BN und HC nur drei Metaboliten mit signifikanten Unterschieden in der Häufigkeit identifiziert (Ergänzungstabelle 2), was mit der Überlappung zwischen BN und HC in PLS-DA übereinstimmt.Diese differenziellen Metaboliten decken ein breites Spektrum biochemischer Stoffe ab (ergänzende Abbildung 4).Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse signifikante Veränderungen im Serummetabolom, die eine bösartige Transformation von Lungenkrebs im Frühstadium im Vergleich zu gutartigen Lungenknötchen oder gesunden Probanden widerspiegeln.Unterdessen legt die Ähnlichkeit des Serummetaboloms von BN und HC nahe, dass gutartige Lungenknötchen viele biologische Merkmale mit gesunden Personen teilen könnten.Angesichts der Tatsache, dass Genmutationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) beim Lungenadenokarzinom-Subtyp 23 häufig vorkommen, wollten wir den Einfluss von Treibermutationen auf das Serummetabolom bestimmen.Anschließend analysierten wir das gesamte metabolische Profil von 72 Fällen mit EGFR-Status in der Lungenadenokarzinomgruppe.Interessanterweise fanden wir in der PCA-Analyse vergleichbare Profile zwischen EGFR-Mutantenpatienten (n = 41) und EGFR-Wildtyp-Patienten (n = 31) (ergänzende Abbildung 5a).Wir identifizierten jedoch 7 Metaboliten, deren Häufigkeit bei Patienten mit EGFR-Mutation im Vergleich zu Patienten mit Wildtyp-EGFR signifikant verändert war (t-Test, p <0,05 und fache Änderung > 1,2 oder <0,83) (ergänzende Abbildung 5b).Der Großteil dieser Metaboliten (5 von 7) sind Acylcarnitine, die eine wichtige Rolle bei den Oxidationswegen von Fettsäuren spielen.
Wie im in Abbildung 2 a dargestellten Arbeitsablauf dargestellt, wurden Biomarker für die Knötchenklassifizierung mithilfe von Operatoren für die geringste absolute Schrumpfung und einer Auswahl auf der Grundlage von 33 in LA (n = 136) und BN (n = 170) identifizierten Differenzialmetaboliten ermittelt.Beste Variablenkombination (LASSO) – binäres logistisches Regressionsmodell.Um die Zuverlässigkeit des Modells zu testen, wurde eine zehnfache Kreuzvalidierung durchgeführt.Variablenauswahl und Parameterregularisierung werden durch einen Wahrscheinlichkeitsmaximierungsabzug mit Parameter λ24 angepasst.Darüber hinaus wurde eine globale Metabolomics-Analyse unabhängig voneinander in den Gruppen interne Validierung (n = 104) und externe Validierung (n = 111) durchgeführt, um die Klassifizierungsleistung des Diskriminanzmodells zu testen.Als Ergebnis wurden 27 Metaboliten im Entdeckungssatz als bestes Diskriminanzmodell mit dem größten mittleren AUC-Wert identifiziert (Abb. 2b), von denen 9 eine erhöhte Aktivität und 18 eine verringerte Aktivität in LA im Vergleich zu BN aufwiesen (Abb. 2c).
Arbeitsablauf zum Erstellen eines Lungenknotenklassifikators, einschließlich der Auswahl der besten Gruppe von Serummetaboliten im Entdeckungssatz mithilfe eines binären logistischen Regressionsmodells über zehnfache Kreuzvalidierung und der Bewertung der Vorhersageleistung in internen und externen Validierungssätzen.b Kreuzvalidierungsstatistik des LASSO-Regressionsmodells für die Auswahl metabolischer Biomarker.Die oben angegebenen Zahlen stellen die durchschnittliche Anzahl der ausgewählten Biomarker bei einem bestimmten λ dar.Die rot gepunktete Linie stellt den durchschnittlichen AUC-Wert beim entsprechenden Lambda dar.Graue Fehlerbalken stellen die minimalen und maximalen AUC-Werte dar.Die gepunktete Linie zeigt das beste Modell mit den 27 ausgewählten Biomarkern.AUC, Fläche unter der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic).c Faltenveränderungen von 27 ausgewählten Metaboliten in der LA-Gruppe im Vergleich zur BN-Gruppe in der Entdeckungsgruppe.Rote Spalte – Aktivierung.Die blaue Säule ist ein Rückgang.d–f Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurven, die die Leistungsfähigkeit des Diskriminanzmodells basierend auf 27 Metabolitenkombinationen in den Entdeckungs-, internen und externen Validierungssätzen zeigen.Quelldaten werden in Form von Quelldatendateien bereitgestellt.
Basierend auf den gewichteten Regressionskoeffizienten dieser 27 Metaboliten wurde ein Vorhersagemodell erstellt (Ergänzungstabelle 3).Die auf diesen 27 Metaboliten basierende ROC-Analyse ergab einen AUC-Wert (Area under the Curve) von 0,933, eine Entdeckungsgruppensensitivität von 0,868 und eine Spezifität von 0,859 (Abb. 2d).Unter den 38 annotierten Differenzialmetaboliten zwischen LA und HC erreichte ein Satz von 16 Metaboliten eine AUC von 0,902 mit einer Sensitivität von 0,801 und einer Spezifität von 0,856 bei der Unterscheidung von LA und HC (ergänzende Abbildung 6a–c).Es wurden auch AUC-Werte verglichen, die auf unterschiedlichen Fold-Change-Schwellenwerten für unterschiedliche Metaboliten basieren.Wir fanden heraus, dass das Klassifizierungsmodell bei der Unterscheidung zwischen LA und BN (HC) am besten abschnitt, wenn der Fold Change Level auf 1,2 gegenüber 1,5 oder 2,0 eingestellt wurde (ergänzende Abbildung 7a,b).Das auf 27 Metabolitengruppen basierende Klassifizierungsmodell wurde in internen und externen Kohorten weiter validiert.Die AUC betrug 0,915 (Sensitivität 0,867, Spezifität 0,811) für die interne Validierung und 0,945 (Sensitivität 0,810, Spezifität 0,979) für die externe Validierung (Abb. 2e, f).Um die Effizienz zwischen Laboren zu bewerten, wurden 40 Proben aus der externen Kohorte in einem externen Labor analysiert, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben.Die Klassifizierungsgenauigkeit erreichte eine AUC von 0,925 (Ergänzende Abbildung 8).Da das Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC) nach dem Lungenadenokarzinom (LUAD) der zweithäufigste Subtyp des nichtkleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC) ist, haben wir auch den validierten potenziellen Nutzen von Stoffwechselprofilen getestet.BN und 16 Fälle von LUSC.Die AUC der Unterscheidung zwischen LUSC und BN betrug 0,776 (ergänzende Abbildung 9), was auf eine schlechtere Fähigkeit im Vergleich zur Unterscheidung zwischen LUAD und BN hinweist.
Studien haben gezeigt, dass die Größe von Knötchen auf CT-Bildern positiv mit der Wahrscheinlichkeit einer Malignität korreliert und weiterhin ein wichtiger Faktor für die Knötchenbehandlung ist25,26,27.Die Analyse der Daten aus der großen Kohorte der NELSON-Screening-Studie zeigte, dass das Malignitätsrisiko bei Probanden mit Knoten < 5 mm sogar dem bei Probanden ohne Knoten ähnelte 28 .Daher beträgt die Mindestgröße, die eine regelmäßige CT-Überwachung erfordert, 5 mm, wie von der British Thoracic Society (BTS) empfohlen, und 6 mm, wie von der Fleischner Society empfohlen 29 .Allerdings bleiben Knötchen, die größer als 6 mm sind und keine offensichtlichen gutartigen Merkmale aufweisen und als unbestimmte Lungenknoten (IPN) bezeichnet werden, eine große Herausforderung bei der Beurteilung und Behandlung in der klinischen Praxis30,31.Als nächstes untersuchten wir anhand gepoolter Proben aus den Entdeckungs- und internen Validierungskohorten, ob die Knötchengröße die metabolischen Signaturen beeinflusst.Wir konzentrierten uns auf 27 validierte Biomarker und verglichen zunächst die PCA-Profile von HC- und BN-Sub-6-mm-Metabolomen.Wir fanden heraus, dass sich die meisten Datenpunkte für HC und BN überlappten, was zeigt, dass die Serummetabolitenspiegel in beiden Gruppen ähnlich waren (Abb. 3a).Die Merkmalskarten über verschiedene Größenbereiche hinweg blieben in BN und LA konserviert (Abb. 3b, c), wohingegen im Bereich von 6–20 mm eine Trennung zwischen bösartigen und gutartigen Knötchen beobachtet wurde (Abb. 3d).Diese Kohorte hatte eine AUC von 0,927, eine Spezifität von 0,868 und eine Sensitivität von 0,820 für die Vorhersage der Bösartigkeit von Knötchen mit einer Größe von 6 bis 20 mm (Abb. 3e, f).Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Klassifikator Stoffwechselveränderungen erfassen kann, die durch eine frühe maligne Transformation verursacht werden, unabhängig von der Knotengröße.
ad Vergleich von PCA-Profilen zwischen bestimmten Gruppen basierend auf einem Stoffwechselklassifikator von 27 Metaboliten.CC und BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs. BN 6–20 mm.in LA 6–20 mm gegenüber LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm und LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve, die die diskriminante Modellleistung für Knötchen 6–20 mm zeigt.f Wahrscheinlichkeitswerte wurden basierend auf dem logistischen Regressionsmodell für Knötchen mit einer Größe von 6–20 mm berechnet.Die graue gepunktete Linie stellt den optimalen Cutoff-Wert dar (0,455).Die obigen Zahlen stellen den Prozentsatz der für Los Angeles prognostizierten Fälle dar.Verwenden Sie einen zweiseitigen Student-t-Test.PCA, Hauptkomponentenanalyse.AUC-Fläche unter der Kurve.Quelldaten werden in Form von Quelldatendateien bereitgestellt.
Vier Proben (Alter 44–61 Jahre) mit ähnlichen Lungenknotengrößen (7–9 mm) wurden weiter ausgewählt, um die Leistung des vorgeschlagenen Malignitätsvorhersagemodells zu veranschaulichen (Abb. 4a, b).Beim ersten Screening stellte sich Fall 1 als fester Knoten mit Verkalkung dar, ein Merkmal, das mit Gutartigkeit verbunden ist, während Fall 2 als unbestimmter, teilweise fester Knoten ohne offensichtliche gutartige Merkmale auftrat.Drei Runden von Folge-CT-Scans zeigten, dass diese Fälle über einen Zeitraum von 4 Jahren stabil blieben und daher als gutartige Knötchen betrachtet wurden (Abb. 4a).Im Vergleich zur klinischen Auswertung serieller CT-Scans identifizierte die Single-Shot-Serummetabolitenanalyse mit dem aktuellen Klassifikatormodell diese gutartigen Knötchen schnell und korrekt auf der Grundlage probabilistischer Einschränkungen (Tabelle 1).Abbildung 4b in Fall 3 zeigt einen Knoten mit Anzeichen einer Pleuraretraktion, die am häufigsten mit einer bösartigen Erkrankung einhergeht32.Fall 4 zeigte einen unbestimmten, teilweise festen Knoten ohne Hinweise auf eine gutartige Ursache.Alle diese Fälle wurden gemäß dem Klassifikatormodell als bösartig vorhergesagt (Tabelle 1).Die Beurteilung des Lungenadenokarzinoms wurde durch histopathologische Untersuchung nach einer Lungenresektionsoperation nachgewiesen (Abb. 4b).Für den externen Validierungssatz hat der Stoffwechselklassifikator zwei Fälle unbestimmter Lungenknötchen mit einer Größe von mehr als 6 mm genau vorhergesagt (ergänzende Abbildung 10).
CT-Bilder des axialen Fensters der Lunge von zwei Fällen gutartiger Knötchen.In Fall 1 zeigte die CT-Untersuchung nach 4 Jahren einen stabilen festen Knoten von 7 mm mit Verkalkung im rechten Unterlappen.Im Fall 2 ergab die CT-Untersuchung nach 5 Jahren einen stabilen, teilweise festen Knoten mit einem Durchmesser von 7 mm im rechten Oberlappen.b Axialfenster-CT-Bilder der Lunge und entsprechende pathologische Untersuchungen von zwei Fällen von Adenokarzinom im Stadium I vor der Lungenresektion.Fall 3 zeigte einen Knoten mit einem Durchmesser von 8 mm im rechten Oberlappen mit Pleuraretraktion.In Fall 4 zeigte sich ein teilweise fester, 9 mm großer Mattglasknoten im linken Oberlappen.Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von reseziertem Lungengewebe (Maßstabsbalken = 50 μm) zeigt das Azinus-Wachstumsmuster eines Lungenadenokarzinoms.Pfeile zeigen Knötchen an, die auf CT-Bildern erkannt wurden.H&E-Bilder sind repräsentative Bilder mehrerer (>3) mikroskopischer Felder, die vom Pathologen untersucht werden.
Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse den potenziellen Wert von Serummetabolit-Biomarkern bei der Differenzialdiagnose von Lungenknötchen, die bei der Beurteilung des CT-Screenings eine Herausforderung darstellen können.
Basierend auf einem validierten Panel differenzierter Metaboliten versuchten wir, biologische Korrelate wichtiger Stoffwechselveränderungen zu identifizieren.Die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse durch MetaboAnalyst identifizierte 6 häufige signifikant veränderte Signalwege zwischen den beiden gegebenen Gruppen (LA vs. HC und LA vs. BN, angepasster p ≤ 0,001, Effekt > 0,01).Diese Veränderungen waren durch Störungen im Pyruvatstoffwechsel, Tryptophanstoffwechsel, Niacin- und Nikotinamidstoffwechsel, Glykolyse, TCA-Zyklus und Purinstoffwechsel gekennzeichnet (Abb. 5a).Anschließend führten wir gezielte Metabolomikanalysen durch, um größere Veränderungen mittels absoluter Quantifizierung zu verifizieren.Bestimmung gemeinsamer Metaboliten in häufig veränderten Signalwegen durch Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (QQQ) unter Verwendung authentischer Metabolitstandards.Die demografischen Merkmale der Zielprobe der Metabolomics-Studie sind in der Ergänzungstabelle 4 enthalten. In Übereinstimmung mit unseren globalen Metabolomics-Ergebnissen bestätigte die quantitative Analyse, dass Hypoxanthin und Xanthin, Pyruvat und Laktat in LA im Vergleich zu BN und HC erhöht waren (Abb. 5b, c, p <0,05).Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in diesen Metaboliten zwischen BN und HC gefunden.
KEGG-Signalweg-Anreicherungsanalyse signifikant unterschiedlicher Metaboliten in der LA-Gruppe im Vergleich zu den BN- und HC-Gruppen.Es wurde ein zweiseitiger Globaltest verwendet und die p-Werte wurden mithilfe der Holm-Bonferroni-Methode angepasst (angepasstes p ≤ 0,001 und Effektgröße > 0,01).b–d Violindiagramme, die die Hypoxanthin-, Xanthin-, Laktat-, Pyruvat- und Tryptophanspiegel in Serum-HC, BN und LA zeigen, bestimmt durch LC-MS/MS (n = 70 pro Gruppe).Weiße und schwarze gepunktete Linien zeigen den Median bzw. das Quartil an.e Violindiagramm, das die normalisierte Log2TPM-mRNA-Expression (Transkripte pro Million) von SLC7A5 und QPRT im Lungenadenokarzinom (n = 513) im Vergleich zu normalem Lungengewebe (n = 59) im LUAD-TCGA-Datensatz zeigt.Das weiße Kästchen stellt den Interquartilbereich dar, die horizontale schwarze Linie in der Mitte stellt den Median dar und die vertikale schwarze Linie, die sich vom Kästchen erstreckt, stellt das 95 %-Konfidenzintervall (CI) dar.f Pearson-Korrelationsdiagramm der SLC7A5- und GAPDH-Expression im Lungenadenokarzinom (n = 513) und im normalen Lungengewebe (n = 59) im TCGA-Datensatz.Der graue Bereich stellt das 95 %-KI dar.r, Pearson-Korrelationskoeffizient.g Normalisierte zelluläre Tryptophanspiegel in A549-Zellen, transfiziert mit unspezifischer shRNA-Kontrolle (NC) und shSLC7A5 (Sh1, Sh2), bestimmt durch LC-MS/MS.Es wird eine statistische Analyse von fünf biologisch unabhängigen Proben in jeder Gruppe vorgestellt.h Zellularspiegel von NADt (Gesamt-NAD, einschließlich NAD+ und NADH) in A549-Zellen (NC) und SLC7A5-Knockdown-A549-Zellen (Sh1, Sh2).Es wird eine statistische Analyse von drei biologisch unabhängigen Proben in jeder Gruppe vorgestellt.i Die glykolytische Aktivität von A549-Zellen vor und nach dem SLC7A5-Knockdown wurde anhand der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) gemessen (n = 4 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe).2-DG,2-Desoxy-D-glucose.In (b–h) wurde der zweiseitige Student-t-Test verwendet.In (g–i) stellen Fehlerbalken den Mittelwert ± SD dar, jedes Experiment wurde dreimal unabhängig durchgeführt und die Ergebnisse waren ähnlich.Quelldaten werden in Form von Quelldatendateien bereitgestellt.
Angesichts der erheblichen Auswirkungen eines veränderten Tryptophanstoffwechsels in der LA-Gruppe haben wir mithilfe von QQQ auch die Serum-Tryptophanspiegel in den HC-, BN- und LA-Gruppen bewertet.Wir fanden heraus, dass das Serum-Tryptophan in LA im Vergleich zu HC oder BN reduziert war (p < 0,001, Abbildung 5d), was mit früheren Erkenntnissen übereinstimmt, dass die zirkulierenden Tryptophanspiegel bei Patienten mit Lungenkrebs niedriger sind als bei gesunden Kontrollpersonen aus der Kontrollgruppe33,34 ,35.Eine weitere Studie mit dem PET/CT-Tracer 11C-Methyl-L-Tryptophan ergab, dass die Tryptophan-Signalretentionszeit im Lungenkrebsgewebe im Vergleich zu gutartigen Läsionen oder normalem Gewebe deutlich verlängert war36.Wir gehen davon aus, dass die Abnahme des Tryptophans im LA-Serum auf die aktive Tryptophan-Aufnahme durch Lungenkrebszellen zurückzuführen sein könnte.
Es ist auch bekannt, dass das Endprodukt des Kynurenin-Weges des Tryptophan-Katabolismus NAD+37,38 ist, das ein wichtiges Substrat für die Reaktion von Glycerinaldehyd-3-phosphat mit 1,3-Bisphosphoglycerat in der Glykolyse ist39.Während sich frühere Studien auf die Rolle des Tryptophan-Katabolismus bei der Immunregulation konzentrierten, wollten wir in der aktuellen Studie das Zusammenspiel zwischen Tryptophan-Dysregulation und glykolytischen Signalwegen aufklären.Der gelöste Transporter der Familie 7, Mitglied 5 (SLC7A5), ist bekanntermaßen ein Tryptophan-Transporter43,44,45.Chinolinsäure-Phosphoribosyltransferase (QPRT) ist ein Enzym, das sich stromabwärts des Kynurenin-Signalwegs befindet und Chinolinsäure in NAMN46 umwandelt.Die Untersuchung des LUAD-TCGA-Datensatzes ergab, dass sowohl SLC7A5 als auch QPRT im Tumorgewebe im Vergleich zu normalem Gewebe signifikant hochreguliert waren (Abb. 5e).Dieser Anstieg wurde in den Stadien I und II sowie in den Stadien III und IV des Lungenadenokarzinoms beobachtet (ergänzende Abbildung 11), was auf frühe Störungen des Tryptophanstoffwechsels im Zusammenhang mit der Tumorentstehung hinweist.
Darüber hinaus zeigte der LUAD-TCGA-Datensatz eine positive Korrelation zwischen der SLC7A5- und GAPDH-mRNA-Expression in Proben von Krebspatienten (r = 0,45, p = 1,55E-26, Abbildung 5f).Im Gegensatz dazu wurde keine signifikante Korrelation zwischen solchen Gensignaturen im normalen Lungengewebe gefunden (r = 0,25, p = 0,06, Abbildung 5f).Durch den Abbau von SLC7A5 (ergänzende Abbildung 12) in A549-Zellen wurden die zellulären Tryptophan- und NAD(H)-Spiegel deutlich reduziert (Abbildung 5g,h), was zu einer abgeschwächten glykolytischen Aktivität führte, gemessen anhand der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) (Abbildung 1).5i).Basierend auf Stoffwechselveränderungen im Serum und dem In-vitro-Nachweis nehmen wir daher an, dass der Tryptophan-Metabolismus über den Kynurenin-Weg NAD+ produzieren und eine wichtige Rolle bei der Förderung der Glykolyse bei Lungenkrebs spielen kann.
Studien haben gezeigt, dass eine große Anzahl unbestimmter Lungenknoten, die durch LDCT erkannt werden, dazu führen kann, dass zusätzliche Tests wie PET-CT, Lungenbiopsie und eine Überbehandlung aufgrund einer falsch positiven Malignitätsdiagnose erforderlich werden.31 Wie in Abbildung 6 dargestellt, Unsere Studie identifizierte eine Reihe von Serummetaboliten mit potenziellem diagnostischem Wert, die die Risikostratifizierung und die anschließende Behandlung von mittels CT erkannten Lungenknoten verbessern können.
Lungenknoten werden mittels Niedrigdosis-Computertomographie (LDCT) beurteilt, wobei Bildmerkmale auf gutartige oder bösartige Ursachen hinweisen.Der unsichere Ausgang von Knötchen kann zu häufigen Nachuntersuchungen, unnötigen Eingriffen und Überbehandlungen führen.Die Einbeziehung von Serum-Stoffwechselklassifikatoren mit diagnostischem Wert kann die Risikobewertung und die anschließende Behandlung von Lungenknoten verbessern.PET-Positronenemissionstomographie.
Daten aus der US-amerikanischen NLST-Studie und der europäischen NELSON-Studie legen nahe, dass das Screening von Hochrisikogruppen mit niedrig dosierter Computertomographie (LDCT) die Lungenkrebsmortalität senken kann1,3.Die Risikobewertung und die anschließende klinische Behandlung einer großen Anzahl zufälliger Lungenknoten, die durch LDCT entdeckt wurden, bleiben jedoch die größte Herausforderung.Das Hauptziel besteht darin, die korrekte Klassifizierung bestehender LDCT-basierter Protokolle durch die Einbeziehung zuverlässiger Biomarker zu optimieren.
Bestimmte molekulare Biomarker, wie z. B. Blutmetaboliten, wurden durch den Vergleich von Lungenkrebs mit gesunden Kontrollpersonen identifiziert15,17.In der aktuellen Studie konzentrierten wir uns auf die Anwendung der Serum-Metabolomik-Analyse zur Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Lungenknötchen, die zufällig durch LDCT entdeckt wurden.Wir verglichen das globale Serummetabolom von Proben gesunder Kontrollpersonen (HC), gutartiger Lungenknötchen (BN) und Lungenadenokarzinomen (LA) im Stadium I mittels UPLC-HRMS-Analyse.Wir fanden heraus, dass HC und BN ähnliche Stoffwechselprofile aufwiesen, wohingegen LA im Vergleich zu HC und BN signifikante Veränderungen aufwies.Wir haben zwei Sätze von Serummetaboliten identifiziert, die LA von HC und BN unterscheiden.
Das aktuelle LDCT-basierte Identifizierungsschema für gutartige und bösartige Knötchen basiert hauptsächlich auf der Größe, Dichte, Morphologie und Wachstumsrate der Knötchen im Laufe der Zeit30.Frühere Studien haben gezeigt, dass die Größe der Knötchen eng mit der Wahrscheinlichkeit von Lungenkrebs zusammenhängt.Selbst bei Hochrisikopatienten beträgt das Malignitätsrisiko bei Knoten <6 mm <1 %.Das Malignitätsrisiko für Knötchen mit einer Größe von 6 bis 20 mm liegt zwischen 8 % und 64 %30.Daher empfiehlt die Fleischner-Gesellschaft einen Cutoff-Durchmesser von 6 mm für die routinemäßige CT-Nachuntersuchung.29 Allerdings wurden die Risikobewertung und das Management unbestimmter Lungenknoten (IPN), die größer als 6 mm sind, nicht ausreichend durchgeführt 31 .Die derzeitige Behandlung angeborener Herzfehler basiert in der Regel auf aufmerksamem Abwarten und häufiger CT-Überwachung.
Basierend auf dem validierten Metabolom konnten wir zum ersten Mal die Überlappung metabolomischer Signaturen zwischen gesunden Personen und gutartigen Knötchen <6 mm nachweisen.Die biologische Ähnlichkeit stimmt mit früheren CT-Ergebnissen überein, wonach das Malignitätsrisiko für Knötchen <6 mm genauso gering ist wie für Probanden ohne Knoten.30 Es ist zu beachten, dass unsere Ergebnisse auch zeigen, dass gutartige Knötchen <6 mm und ≥6 mm ein hohes Risiko haben Ähnlichkeit in den metabolomischen Profilen, was darauf hindeutet, dass die funktionelle Definition der gutartigen Ätiologie unabhängig von der Knotengröße konsistent ist.Daher können moderne diagnostische Serummetaboliten-Panels einen einzigen Test als Ausschlusstest bereitstellen, wenn Knötchen erstmals im CT erkannt werden, und möglicherweise die serielle Überwachung reduzieren.Gleichzeitig unterschied dasselbe Panel metabolischer Biomarker bösartige Knötchen mit einer Größe von ≥6 mm von gutartigen Knötchen und lieferte genaue Vorhersagen für IPNs ähnlicher Größe und mehrdeutiger morphologischer Merkmale auf CT-Bildern.Dieser Klassifikator für den Serumstoffwechsel schnitt bei der Vorhersage der Malignität von Knötchen ≥6 mm mit einer AUC von 0,927 gut ab.Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass einzigartige metabolische Signaturen im Serum spezifisch frühe tumorinduzierte Stoffwechselveränderungen widerspiegeln und unabhängig von der Knötchengröße einen potenziellen Wert als Risikoprädiktoren haben können.
Insbesondere das Lungenadenokarzinom (LUAD) und das Plattenepithelkarzinom (LUSC) sind die Haupttypen des nichtkleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).Da LUSC stark mit Tabakkonsum assoziiert ist47 und LUAD die häufigste Histologie von zufälligen Lungenknötchen ist, die beim CT-Screening entdeckt wurden48, wurde unser Klassifikationsmodell speziell für Adenokarzinomproben im Stadium I entwickelt.Wang und Kollegen konzentrierten sich ebenfalls auf LUAD und identifizierten mithilfe von Lipidomics neun Lipidsignaturen, um Lungenkrebs im Frühstadium von gesunden Personen zu unterscheiden17.Wir haben das aktuelle Klassifikationsmodell an 16 Fällen von LUSC im Stadium I und 74 gutartigen Knötchen getestet und eine geringe LUSC-Vorhersagegenauigkeit (AUC 0,776) beobachtet, was darauf hindeutet, dass LUAD und LUSC möglicherweise ihre eigenen metabolischen Signaturen haben.Tatsächlich wurde gezeigt, dass sich LUAD und LUSC in der Ätiologie, dem biologischen Ursprung und den genetischen Aberrationen unterscheiden49.Daher sollten andere Arten der Histologie in Trainingsmodelle zur bevölkerungsbasierten Erkennung von Lungenkrebs in Screening-Programmen einbezogen werden.
Hier identifizierten wir die sechs am häufigsten veränderten Signalwege beim Lungenadenokarzinom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen und gutartigen Knötchen.Xanthin und Hypoxanthin sind häufige Metaboliten des Purin-Stoffwechselwegs.In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen waren die mit dem Purinstoffwechsel verbundenen Zwischenprodukte im Serum oder Gewebe von Patienten mit Lungenadenokarzinom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen oder Patienten im präinvasiven Stadium signifikant erhöht15,50.Erhöhte Xanthin- und Hypoxanthinspiegel im Serum können auf den Anabolismus zurückzuführen sein, der für schnell wachsende Krebszellen erforderlich ist.Eine Fehlregulation des Glukosestoffwechsels ist ein bekanntes Kennzeichen des Krebsstoffwechsels51.Hier beobachteten wir einen signifikanten Anstieg von Pyruvat und Laktat in der LA-Gruppe im Vergleich zur HC- und BN-Gruppe, was mit früheren Berichten über Anomalien des glykolytischen Signalwegs in den Serummetabolomprofilen von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) übereinstimmt gesunde Kontrollen.Die Ergebnisse sind konsistent52,53.
Wichtig ist, dass wir im Serum von Lungenadenokarzinomen eine umgekehrte Korrelation zwischen Pyruvat- und Tryptophanstoffwechsel beobachteten.Der Tryptophanspiegel im Serum war in der LA-Gruppe im Vergleich zur HC- oder BN-Gruppe verringert.Interessanterweise ergab eine frühere groß angelegte Studie mit einer prospektiven Kohorte, dass niedrige Spiegel an zirkulierendem Tryptophan mit einem erhöhten Lungenkrebsrisiko verbunden waren 54 .Tryptophan ist eine essentielle Aminosäure, die wir vollständig über die Nahrung aufnehmen.Wir kommen zu dem Schluss, dass der Tryptophanmangel im Serum bei Lungenadenokarzinomen auf einen schnellen Abbau dieses Metaboliten zurückzuführen sein könnte.Es ist bekannt, dass das Endprodukt des Tryptophan-Katabolismus über den Kynurenin-Weg die Quelle der De-novo-NAD+-Synthese ist.Da NAD+ hauptsächlich über den Salvage-Weg produziert wird, muss die Bedeutung von NAD+ für den Tryptophanstoffwechsel für Gesundheit und Krankheit noch ermittelt werden46.Unsere Analyse der TCGA-Datenbank zeigte, dass die Expression des Tryptophan-Transporters Solute Transporter 7A5 (SLC7A5) bei Lungenadenokarzinomen im Vergleich zu normalen Kontrollen signifikant erhöht war und positiv mit der Expression des glykolytischen Enzyms GAPDH korrelierte.Frühere Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf die Rolle des Tryptophan-Katabolismus bei der Unterdrückung der Antitumor-Immunantwort40,41,42.Hier zeigen wir, dass die Hemmung der Tryptophan-Aufnahme durch den Abbau von SLC7A5 in Lungenkrebszellen zu einer anschließenden Abnahme der zellulären NAD-Spiegel und einer damit einhergehenden Abschwächung der glykolytischen Aktivität führt.Zusammenfassend liefert unsere Studie eine biologische Grundlage für Veränderungen im Serumstoffwechsel, die mit der malignen Transformation von Lungenadenokarzinomen verbunden sind.
EGFR-Mutationen sind die häufigsten Treibermutationen bei Patienten mit NSCLC.In unserer Studie stellten wir fest, dass Patienten mit EGFR-Mutation (n = 41) insgesamt ähnliche Stoffwechselprofile aufwiesen wie Patienten mit Wildtyp-EGFR (n = 31), obwohl wir bei einigen Patienten mit EGFR-Mutation bei Acylcarnitin-Patienten verringerte Serumspiegel fanden.Die nachgewiesene Funktion von Acylcarnitinen besteht darin, Acylgruppen vom Zytoplasma in die mitochondriale Matrix zu transportieren, was zur Oxidation von Fettsäuren zur Energieerzeugung führt 55 .In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen identifizierte eine kürzlich durchgeführte Studie auch ähnliche Metabolomprofile zwischen EGFR-Mutanten- und EGFR-Wildtyp-Tumoren, indem sie das globale Metabolom von 102 Lungenadenokarzinom-Gewebeproben analysierte50.Interessanterweise wurde der Acylcarnitin-Gehalt auch in der EGFR-Mutantengruppe gefunden.Ob Veränderungen im Acylcarnitinspiegel EGFR-induzierte Stoffwechselveränderungen und die zugrunde liegenden molekularen Wege widerspiegeln, könnte daher eine weitere Untersuchung wert sein.
Zusammenfassend stellt unsere Studie einen Serumstoffwechselklassifikator für die Differenzialdiagnose von Lungenknoten fest und schlägt einen Arbeitsablauf vor, der die Risikobewertung optimieren und das klinische Management auf der Grundlage eines CT-Scan-Screenings erleichtern kann.
Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Sun Yat-sen University Cancer Hospital, dem First Affiliated Hospital der Sun Yat-sen University und der Ethics Commission des Zhengzhou University Cancer Hospital genehmigt.In den Entdeckungs- und internen Validierungsgruppen wurden 174 Seren von gesunden Personen und 244 Seren von gutartigen Knötchen von Personen gesammelt, die sich jährlichen medizinischen Untersuchungen in der Abteilung für Krebskontrolle und -prävention des Krebszentrums der Sun Yat-sen-Universität unterzogen, sowie 166 gutartige Knötchen.Serum.Lungenadenokarzinome im Stadium I wurden am Sun Yat-sen University Cancer Center gesammelt.In der externen Validierungskohorte gab es 48 Fälle von gutartigen Knötchen, 39 Fälle von Lungenadenokarzinom im Stadium I aus dem First Affiliated Hospital der Sun Yat-sen-Universität und 24 Fälle von Lungenadenokarzinom im Stadium I aus dem Zhengzhou Cancer Hospital.Das Sun Yat-sen University Cancer Center sammelte außerdem 16 Fälle von Plattenepithelkarzinomen der Lunge im Stadium I, um die diagnostische Fähigkeit des etablierten Stoffwechselklassifikators zu testen (Patienteneigenschaften sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt).Proben aus der Entdeckungskohorte und der internen Validierungskohorte wurden zwischen Januar 2018 und Mai 2020 gesammelt. Proben für die externe Validierungskohorte wurden zwischen August 2021 und Oktober 2022 gesammelt. Um geschlechtsspezifische Verzerrungen zu minimieren, wurden jeder ungefähr die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fälle zugewiesen Kohorte.Discovery-Team und internes Überprüfungsteam.Das Geschlecht der Teilnehmer wurde anhand der Selbstauskunft bestimmt.Die Einverständniserklärung aller Teilnehmer wurde eingeholt und es wurde keine Entschädigung gewährt.Bei den Probanden mit gutartigen Knötchen handelte es sich um diejenigen mit einem stabilen CT-Scan-Score nach 2 bis 5 Jahren zum Zeitpunkt der Analyse, mit Ausnahme eines Falles aus der externen Validierungsprobe, die präoperativ entnommen und histopathologisch diagnostiziert wurde.Mit Ausnahme der chronischen Bronchitis.Fälle von Lungenadenokarzinom wurden vor der Lungenresektion gesammelt und durch pathologische Diagnose bestätigt.Nüchternblutproben wurden in Serumtrennröhrchen ohne Antikoagulanzien gesammelt.Blutproben wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geronnen und dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 2851 × g zentrifugiert, um den Serumüberstand zu sammeln.Serumaliquots wurden bis zur Metabolitenextraktion bei -80 °C eingefroren.Die Abteilung für Krebsprävention und medizinische Untersuchung des Krebszentrums der Sun Yat-sen-Universität sammelte einen Serumpool von 100 gesunden Spendern, darunter gleich viele Männer und Frauen im Alter von 40 bis 55 Jahren.Gleiche Volumina jeder Spenderprobe wurden gemischt, der resultierende Pool wurde aliquotiert und bei -80 °C gelagert.Die Serummischung wurde als Referenzmaterial zur Qualitätskontrolle und Datenstandardisierung verwendet.
Referenzserum und Testproben wurden aufgetaut und Metaboliten mithilfe einer kombinierten Extraktionsmethode (MTBE/Methanol/Wasser) extrahiert 56 .Kurz gesagt wurden 50 μl Serum mit 225 μl eiskaltem Methanol und 750 μl eiskaltem Methyl-tert-butylether (MTBE) gemischt.Rühren Sie die Mischung um und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang auf Eis.Anschließend wurden die Proben gemischt und mit 188 μl Wasser in MS-Qualität, das interne Standards enthielt (13C-Lactat, 13C3-Pyruvat, 13C-Methionin und 13C6-Isoleucin, gekauft von Cambridge Isotope Laboratories), gemischt und vortexiert.Die Mischung wurde dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 × g zentrifugiert und die untere Phase zur LC-MS-Analyse im positiven und negativen Modus in zwei Röhrchen (jeweils 125 μl) überführt.Abschließend wurde die Probe in einem Hochgeschwindigkeits-Vakuumkonzentrator zur Trockne eingedampft.
Die getrockneten Metaboliten wurden in 120 μl 80 %igem Acetonitril rekonstituiert, 5 Minuten lang gevortext und 10 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 × g zentrifugiert.Für Metabolomics-Studien wurden die Überstände in Braunglasfläschchen mit Mikroeinsätzen überführt.Ungezielte Metabolomics-Analyse auf einer Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-hochauflösenden Massenspektrometrie-Plattform (UPLC-HRMS).Die Metaboliten wurden mit einem Dionex Ultimate 3000 UPLC-System und einer ACQUITY BEH Amide-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) getrennt.Im Positivionenmodus bestanden die mobilen Phasen aus 95 % (A) und 50 % Acetonitril (B), die jeweils 10 mmol/L Ammoniumacetat und 0,1 % Ameisensäure enthielten.Im negativen Modus enthielten die mobilen Phasen A und B 95 % bzw. 50 % Acetonitril, beide Phasen enthielten 10 mmol/L Ammoniumacetat, pH = 9. Das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–0,5 min, 2 % B;0,5–12 Min., 2–50 % B;12–14 Min., 50–98 % B;14–16 Min., 98 % B;16–16.1.min. 98 –2 % B;16,1–20 Min., 2 % B. Die Säule wurde im Autosampler bei 40 °C und die Probe bei 10 °C gehalten.Die Flussrate betrug 0,3 ml/min, das Injektionsvolumen betrug 3 μl.Ein Q-Exactive Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) wurde im Vollscanmodus betrieben und mit dem ddMS2-Überwachungsmodus gekoppelt, um große Datenmengen zu sammeln.Die MS-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Sprühspannung +3,8 kV/- 3,2 kV, Kapillartemperatur 320 °C, Schutzgas 40 Arb, Hilfsgas 10 Arb, Sondenheizungstemperatur 350 °C, Scanbereich 70–1050 m/h, Auflösung.70.000. Die Daten wurden mit Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) erfasst.
Zur Beurteilung der Datenqualität wurden gepoolte Qualitätskontrollproben (QC) erstellt, indem 10 μl-Aliquots des Überstands aus jeder Probe entnommen wurden.Zu Beginn der Analysesequenz wurden sechs Injektionen von Qualitätskontrollproben analysiert, um die Stabilität des UPLC-MS-Systems zu beurteilen.Anschließend werden der Charge regelmäßig Qualitätskontrollproben hinzugefügt.Alle 11 Chargen von Serumproben in dieser Studie wurden mittels LC-MS analysiert.Aliquots einer Serum-Pool-Mischung von 100 gesunden Spendern wurden in den jeweiligen Chargen als Referenzmaterial verwendet, um den Extraktionsprozess zu überwachen und die Auswirkungen von Charge zu Charge auszugleichen.Am Metabolomics Center der Sun Yat-sen-Universität wurde eine ungezielte Metabolomics-Analyse der Entdeckungskohorte, der internen Validierungskohorte und der externen Validierungskohorte durchgeführt.Das externe Labor des Analyse- und Testzentrums der Guangdong University of Technology analysierte außerdem 40 Proben aus der externen Kohorte, um die Leistung des Klassifikatormodells zu testen.
Nach der Extraktion und Rekonstitution wurde die absolute Quantifizierung der Serummetaboliten mithilfe einer Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (Agilent 6495 Triple Quadrupol) mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) im Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus gemessen.Zur Trennung der Metaboliten wurde eine ACQUITY BEH Amide-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) verwendet.Die mobile Phase bestand aus 90 % (A) und 5 % Acetonitril (B) mit 10 mmol/L Ammoniumacetat und 0,1 % Ammoniaklösung.Das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–1,5 min, 0 % B;1,5–6,5 Min., 0–15 % B;6,5–8 Min., 15 % B;8–8,5 Min., 15 %–0 % B;8,5–11,5 Min., 0 % B.Die Säule wurde im Autosampler auf 40 °C und die Probe auf 10 °C gehalten.Die Flussrate betrug 0,3 ml/min und das Injektionsvolumen betrug 1 μL.Die MS-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Kapillarspannung ±3,5 kV, Zerstäuberdruck 35 psi, Hüllgasfluss 12 l/min, Hüllgastemperatur 350 °C, Trocknungsgastemperatur 250 °C und Trocknungsgasfluss 14 l/min.Die MRM-Umsätze von Tryptophan, Pyruvat, Laktat, Hypoxanthin und Xanthin betrugen 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 und 151,0–107.9 bzw.Die Daten wurden mit Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) gesammelt.Für Serumproben wurden Tryptophan, Pyruvat, Laktat, Hypoxanthin und Xanthin mithilfe von Kalibrierungskurven von Standardmischungslösungen quantifiziert.Für Zellproben wurde der Tryptophangehalt auf den internen Standard und die Zellproteinmasse normalisiert.
Die Peakextraktion (m/z und Retentionszeit (RT)) wurde mit Compound Discovery 3.1 und TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt.Um mögliche Unterschiede zwischen den Chargen auszuschließen, wurde jeder charakteristische Peak der Testprobe durch den charakteristischen Peak des Referenzmaterials aus derselben Charge dividiert, um die relative Häufigkeit zu erhalten.Die relativen Standardabweichungen der internen Standards vor und nach der Standardisierung sind in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt. Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden durch die Falscherkennungsrate (FDR < 0,05, Wilcoxon-Signed-Rank-Test) und die Faltungsänderung (> 1,2 oder < 0,83) gekennzeichnet.Rohe MS-Daten der extrahierten Merkmale und serumkorrigierte MS-Referenzdaten werden in den Ergänzungsdaten 1 bzw. Ergänzungsdaten 2 angezeigt.Die Peakannotation wurde auf der Grundlage von vier definierten Identifizierungsebenen durchgeführt, darunter identifizierte Metaboliten, mutmaßlich annotierte Verbindungen, mutmaßlich charakterisierte Verbindungsklassen und unbekannte Verbindungen 22 .Basierend auf Datenbanksuchen in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) wurden schließlich biologische Verbindungen mit MS/MS-Übereinstimmung mit validierten Standards oder Annotationen mit exakter Übereinstimmung in mzCloud (Score > 85) oder Chemspider als Zwischenprodukte zwischen dem differenziellen Metabolom ausgewählt.Peakanmerkungen für jedes Merkmal sind in den Zusatzdaten 3 enthalten. MetaboAnalyst 5.0 wurde für die univariate Analyse der summennormalisierten Metabolitenhäufigkeit verwendet.MetaboAnalyst 5.0 evaluierte auch die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse basierend auf deutlich unterschiedlichen Metaboliten.Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) wurden mit dem ropls-Softwarepaket (v.1.26.4) mit Stapelnormalisierung und automatischer Skalierung analysiert.Das optimale Metabolit-Biomarker-Modell zur Vorhersage der Knötchenmalignität wurde mithilfe der binären logistischen Regression mit der geringsten absoluten Schrumpfung und dem Auswahloperator (LASSO, R-Paket v.4.1-3) generiert.Die Leistung des Diskriminanzmodells in den Erkennungs- und Validierungssätzen wurde durch die Schätzung der AUC basierend auf der ROC-Analyse gemäß dem pROC-Paket (v.1.18.0.) charakterisiert.Der optimale Wahrscheinlichkeitsgrenzwert wurde basierend auf dem maximalen Youden-Index des Modells (Sensitivität + Spezifität – 1) ermittelt.Proben mit Werten, die unter oder über dem Schwellenwert liegen, werden als gutartige Knötchen bzw. Lungenadenokarzinom vorhergesagt.
A549-Zellen (#CCL-185, American Type Culture Collection) wurden in F-12K-Medium mit 10 % FBS gezüchtet.Kurze Haarnadel-RNA-Sequenzen (shRNA), die auf SLC7A5 und eine nicht zielgerichtete Kontrolle (NC) abzielen, wurden in den lentiviralen Vektor pLKO.1-puro eingefügt.Die Antisense-Sequenzen von shSLC7A5 sind wie folgt: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antikörper gegen SLC7A5 (#5347) und Tubulin (#2148) wurden von Cell Signaling Technology erworben.Antikörper gegen SLC7A5 und Tubulin wurden in einer Verdünnung von 1:1000 für die Western-Blot-Analyse verwendet.
Der glykolytische Stresstest Seahorse XF misst den Grad der extrazellulären Versauerung (ECAR).Im Test wurden Glucose, Oligomycin A und 2-DG nacheinander verabreicht, um die zelluläre glykolytische Kapazität, gemessen mit ECAR, zu testen.
Mit Non-Targeting Control (NC) und shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfizierte A549-Zellen wurden über Nacht in Schalen mit 10 cm Durchmesser ausplattiert.Zellmetaboliten wurden mit 1 ml eiskaltem 80 % wässrigem Methanol extrahiert.Zellen in der Methanollösung wurden abgekratzt, in einem neuen Röhrchen gesammelt und 15 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 × g zentrifugiert.Sammeln Sie 800 µl Überstand und trocknen Sie ihn mit einem Hochgeschwindigkeits-Vakuumkonzentrator.Die getrockneten Metabolitenpellets wurden dann wie oben beschrieben mittels LC-MS/MS auf Tryptophanspiegel analysiert.Die zellulären NAD(H)-Spiegel in A549-Zellen (NC und shSLC7A5) wurden mit einem quantitativen kolorimetrischen NAD+/NADH-Kit (#K337, BioVision) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.Für jede Probe wurden die Proteingehalte gemessen, um die Menge an Metaboliten zu normalisieren.
Zur vorläufigen Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet.Frühere Metabolomics-Studien zur Entdeckung von Biomarkern15,18 wurden als Maßstab für die Größenbestimmung angesehen, und im Vergleich zu diesen Berichten war unsere Stichprobe ausreichend.Es wurden keine Proben aus der Studienkohorte ausgeschlossen.Serumproben wurden nach dem Zufallsprinzip einer Entdeckungsgruppe (306 Fälle, 74,6 %) und einer internen Validierungsgruppe (104 Fälle, 25,4 %) für ungezielte Metabolomics-Studien zugeordnet.Wir haben außerdem zufällig 70 Fälle aus jeder Gruppe aus dem Entdeckungssatz für gezielte Metabolomics-Studien ausgewählt.Während der LC-MS-Datenerfassung und -analyse waren die Forscher hinsichtlich der Gruppenzuordnung blind.Statistische Analysen von Metabolomics-Daten und Zellexperimenten werden in den jeweiligen Abschnitten „Ergebnisse“, „Abbildungslegenden“ und „Methoden“ beschrieben.Die Quantifizierung der zellulären Tryptophan-, NADT- und glykolytischen Aktivität wurde dreimal unabhängig voneinander mit identischen Ergebnissen durchgeführt.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie in der Zusammenfassung des Natural Portfolio Reports, die diesem Artikel zugeordnet ist.
Die rohen MS-Daten der extrahierten Merkmale und die normalisierten MS-Daten des Referenzserums werden in den Ergänzungsdaten 1 bzw. Ergänzungsdaten 2 angezeigt.Spitzenanmerkungen für differenzielle Merkmale werden in den Zusatzdaten 3 dargestellt. Der LUAD TCGA-Datensatz kann von https://portal.gdc.cancer.gov/ heruntergeladen werden.Die Eingabedaten zum Zeichnen des Diagramms werden in den Quelldaten bereitgestellt.Für diesen Artikel werden Quelldaten bereitgestellt.
Nationale Lungenscreening-Studiengruppe usw. Reduzierung der Lungenkrebssterblichkeit durch niedrig dosierte Computertomographie.Nordengland.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR und Prophet, PC Lungenkrebs-Screening mittels niedrig dosierter Spiral-CT: Ergebnisse der National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Bildschirm 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Reduzierung der Lungenkrebsmortalität durch volumetrisches CT-Screening in einer randomisierten Studie.Nordengland.J. Med.382, 503–513 (2020).
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 18.09.2023