Die Differenzialdiagnose von mittels Computertomographie (CT) identifizierten Lungenrundherden stellt in der klinischen Praxis weiterhin eine Herausforderung dar. In dieser Studie charakterisierten wir das globale Metabolom von 480 Serumproben, darunter Proben von gesunden Kontrollpersonen, benignen Lungenrundherden und Adenokarzinomen der Lunge im Stadium I. Adenokarzinome weisen einzigartige Metabolomprofile auf, während benigne Rundherde und gesunde Personen eine hohe Ähnlichkeit in ihren Metabolomprofilen zeigen. In der Entdeckungsgruppe (n = 306) wurde ein Set von 27 Metaboliten identifiziert, die zwischen benignen und malignen Rundherden differenzieren. Die AUC des Diskriminanzmodells betrug in der internen Validierungsgruppe (n = 104) 0,915 und in der externen Validierungsgruppe (n = 111) 0,945. Die Analyse der Stoffwechselwege zeigte erhöhte glykolytische Metaboliten in Verbindung mit einem verringerten Tryptophanspiegel im Serum von Patienten mit Lungenadenokarzinom im Vergleich zu Patienten mit benignen Lungenrundherden und gesunden Kontrollpersonen. Dies deutet darauf hin, dass die Tryptophanaufnahme die Glykolyse in Lungenkrebszellen fördert. Unsere Studie unterstreicht den Wert von Serummetabolit-Biomarkern für die Risikobewertung von mittels CT detektierten Lungenrundherden.
Die Früherkennung ist entscheidend für die Verbesserung der Überlebensraten von Krebspatienten. Ergebnisse der US-amerikanischen National Lung Cancer Screening Trial (NLST) und der europäischen NELSON-Studie haben gezeigt, dass das Screening mittels Niedrigdosis-Computertomographie (LDCT) die Lungenkrebssterblichkeit in Hochrisikogruppen signifikant senken kann1,2,3. Seit der weitverbreiteten Anwendung der LDCT im Lungenkrebs-Screening hat die Inzidenz von zufällig entdeckten asymptomatischen Lungenrundherden im Röntgenbild kontinuierlich zugenommen4. Lungenrundherde sind definiert als fokale Verschattungen mit einem Durchmesser von bis zu 3 cm5. Die Beurteilung der Wahrscheinlichkeit einer Malignität und der Umgang mit der großen Anzahl zufällig in der LDCT entdeckter Lungenrundherde stellen uns vor Herausforderungen. Limitationen der CT können zu häufigen Nachuntersuchungen und falsch-positiven Ergebnissen führen, was unnötige Interventionen und Übertherapie zur Folge haben kann6. Daher besteht Bedarf an der Entwicklung zuverlässiger und nützlicher Biomarker, um Lungenkrebs in frühen Stadien korrekt zu identifizieren und die meisten gutartigen Rundherde bei der Erstdiagnose zu differenzieren7.
Die umfassende molekulare Analyse von Blut (Serum, Plasma, peripheren mononukleären Blutzellen), einschließlich Genomik, Proteomik und DNA-Methylierung8,9,10, hat das Interesse an der Entdeckung diagnostischer Biomarker für Lungenkrebs verstärkt. Metabolomische Ansätze messen zelluläre Endprodukte, die durch endogene und exogene Faktoren beeinflusst werden und daher zur Vorhersage von Krankheitsbeginn und -verlauf eingesetzt werden. Die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) ist aufgrund ihrer hohen Sensitivität und ihres großen dynamischen Bereichs eine weit verbreitete Methode für metabolomische Studien, da sie Metaboliten mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften erfassen kann11,12,13. Obwohl die globale metabolomische Analyse von Plasma/Serum bereits zur Identifizierung von Biomarkern im Zusammenhang mit der Lungenkrebsdiagnose14,15,16,17 und der Behandlungseffektivität18 eingesetzt wurde, besteht weiterhin Forschungsbedarf hinsichtlich der Klassifizierung von Serummetaboliten zur Unterscheidung zwischen benignen und malignen Lungenknoten.
Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom sind die beiden Hauptsubtypen des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC). Verschiedene CT-Screening-Untersuchungen zeigen, dass das Adenokarzinom der häufigste histologische Typ von Lungenkrebs ist1,19,20,21. In dieser Studie führten wir mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Hochauflösungs-Massenspektrometrie (UPLC-HRMS) eine Metabolomanalyse an insgesamt 695 Serumproben durch, darunter Proben von gesunden Kontrollpersonen, benignen Lungenrundherden und CT-detektierten ≤3 cm großen Lungenadenokarzinomen im Stadium I. Wir identifizierten ein Panel von Serummetaboliten, die Lungenadenokarzinome von benignen Rundherden und gesunden Kontrollpersonen unterscheiden. Die Pathway-Enrichment-Analyse ergab, dass ein abnormaler Tryptophan- und Glukosestoffwechsel häufige Veränderungen bei Lungenadenokarzinomen im Vergleich zu benignen Rundherden und gesunden Kontrollpersonen darstellen. Schließlich haben wir einen Serum-Metabolismus-Klassifikator mit hoher Spezifität und Sensitivität etabliert und validiert, der zwischen malignen und benignen Lungenrundherden, die mittels LDCT detektiert wurden, unterscheiden kann und der bei der frühen Differenzialdiagnose und Risikobewertung hilfreich sein kann.
In der vorliegenden Studie wurden retrospektiv geschlechts- und altersentsprechende Serumproben von 174 gesunden Kontrollpersonen, 292 Patienten mit benignen Lungenrundherden und 229 Patienten mit Lungenadenokarzinom im Stadium I gesammelt. Die demografischen Merkmale der 695 Studienteilnehmer sind in Tabelle S1 (im Anhang) dargestellt.
Wie in Abbildung 1a dargestellt, wurden am Krebszentrum der Sun-Yat-sen-Universität insgesamt 480 Serumproben gesammelt, darunter 174 Proben gesunder Kontrollpersonen (HC), 170 Proben benigner Lungenrundherde (BN) und 136 Proben von Lungenadenokarzinomen im Stadium I (LA). Diese Proben dienten der Entdeckung einer Kohorte für die ungerichtete metabolomische Profilierung mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Hochauflösungs-Massenspektrometrie (UPLC-HRMS). Wie in Abbildung S1 (im Anhang) dargestellt, wurden differentielle Metaboliten zwischen LA und HC sowie zwischen LA und BN identifiziert, um ein Klassifizierungsmodell zu erstellen und die differentiellen Stoffwechselwege weiter zu analysieren. 104 Proben des Krebszentrums der Sun-Yat-sen-Universität und 111 Proben aus zwei weiteren Krankenhäusern wurden einer internen bzw. externen Validierung unterzogen.
a Studienpopulation der Entdeckungskohorte, die einer globalen Serum-Metabolomanalyse mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Hochauflösungs-Massenspektrometrie (UPLC-HRMS) unterzogen wurde. b Partielle Least-Squares-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) des Gesamtmetaboloms von 480 Serumproben der Studienkohorte, darunter gesunde Kontrollen (HC, n = 174), benigne Knoten (BN, n = 170) und Adenokarzinom der Lunge im Stadium I (Los Angeles, n = 136). +ESI, positiver Elektrospray-Ionisationsmodus, -ESI, negativer Elektrospray-Ionisationsmodus. c–e Metaboliten mit signifikant unterschiedlichen Häufigkeiten in zwei Gruppen (zweiseitiger Wilcoxon-Vorzeichenrangtest, FDR-korrigierter p-Wert, FDR < 0,05) sind rot (Fold Change > 1,2) und blau (Fold Change < 0,83) dargestellt. (Vulkandiagramm) f Hierarchische Cluster-Heatmap, die signifikante Unterschiede in der Anzahl der annotierten Metaboliten zwischen LA und BN aufzeigt. Die Quelldaten werden in Form von Quelldateien bereitgestellt.
Das gesamte Serummetabolom von 174 gesunden Kontrollpersonen (HC), 170 BN-Proben und 136 LA-Proben der Entdeckungsgruppe wurde mittels UPLC-HRMS-Analyse untersucht. Zunächst zeigen wir, dass die Qualitätskontrollproben (QC-Proben) im Zentrum eines unüberwachten Hauptkomponentenanalysemodells (PCA) eng beieinander liegen, was die Stabilität der Ergebnisse dieser Studie bestätigt (Ergänzende Abbildung 2).
Wie die partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) in Abbildung 1b zeigt, ergaben sich deutliche Unterschiede zwischen LA und BN sowie zwischen LA und HC im positiven (+ESI) und negativen (−ESI) Elektrospray-Ionisationsmodus. Zwischen BN und HC wurden hingegen unter +ESI- und −ESI-Bedingungen keine signifikanten Unterschiede festgestellt.
Wir fanden 382 differentielle Merkmale zwischen LA und HC, 231 differentielle Merkmale zwischen LA und BN sowie 95 differentielle Merkmale zwischen BN und HC (Wilcoxon-Vorzeichenrangtest, FDR < 0,05 und multiple Änderung > 1,2 oder < 0,83) (Abbildung 1c–e). Die Peaks wurden anschließend anhand des m/z-Werts, der Retentionszeit und des Fragmentierungs-Massenspektrums (Details siehe Methoden)22 mithilfe einer Datenbank (mzCloud/HMDB/Chemspider-Bibliothek) annotiert (Ergänzende Daten 3). Schließlich wurden 33 bzw. 38 annotierte Metaboliten mit signifikanten Unterschieden in der Häufigkeit für LA versus BN (Abbildung 1f und Ergänzende Tabelle 2) bzw. LA versus HC (Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Tabelle 2) identifiziert. Im Gegensatz dazu wurden in BN und HC nur drei Metaboliten mit signifikanten Konzentrationsunterschieden identifiziert (Ergänzungstabelle 2), was mit der Überlappung zwischen BN und HC in der PLS-DA übereinstimmt. Diese differentiellen Metaboliten umfassen ein breites Spektrum an biochemischen Substanzen (Ergänzungsabbildung 4). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse signifikante Veränderungen im Serummetabolom, die die maligne Transformation von Lungenkrebs im Frühstadium im Vergleich zu benignen Lungenrundherden oder gesunden Probanden widerspiegeln. Die Ähnlichkeit des Serummetaboloms von BN und HC legt nahe, dass benigne Lungenrundherde viele biologische Merkmale mit gesunden Individuen teilen. Da Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor-Gens (EGFR) häufig im Lungenadenokarzinom-Subtyp 23 vorkommen, untersuchten wir den Einfluss von Treibermutationen auf das Serummetabolom. Dazu analysierten wir das Gesamtmetabolomprofil von 72 Fällen mit EGFR-Status innerhalb der Lungenadenokarzinom-Gruppe. Interessanterweise fanden wir in der PCA-Analyse vergleichbare Profile zwischen Patienten mit EGFR-Mutation (n = 41) und Patienten mit EGFR-Wildtyp (n = 31) (Ergänzende Abbildung 5a). Wir identifizierten jedoch 7 Metaboliten, deren Konzentration bei Patienten mit EGFR-Mutation im Vergleich zu Patienten mit EGFR-Wildtyp signifikant verändert war (t-Test, p < 0,05 und Veränderung > 1,2 oder < 0,83) (Ergänzende Abbildung 5b). Die Mehrheit dieser Metaboliten (5 von 7) sind Acylcarnitine, die eine wichtige Rolle in Fettsäureoxidationswegen spielen.
Wie im Workflow in Abbildung 2a dargestellt, wurden Biomarker für die Knotenklassifizierung mittels Least Absolute Shrinkage Operators (LASSO) und einer Selektion basierend auf 33 in LA (n = 136) und BN (n = 170) identifizierten differentiellen Metaboliten gewonnen. Es wurde ein LASSO-basiertes binäres logistisches Regressionsmodell verwendet. Die Zuverlässigkeit des Modells wurde mittels zehnfacher Kreuzvalidierung geprüft. Variablenselektion und Parameterregularisierung wurden durch eine Likelihood-Maximierungs-Regularisierung mit dem Parameter λ24 angepasst. Zusätzlich wurde eine globale Metabolomanalyse unabhängig in der internen (n = 104) und externen Validierungsgruppe (n = 111) durchgeführt, um die Klassifizierungsleistung des Diskriminanzmodells zu testen. Dabei wurden 27 Metaboliten im Entdeckungsdatensatz als bestes Diskriminanzmodell mit dem größten mittleren AUC-Wert identifiziert (Abb. 2b). Neun dieser Metaboliten zeigten in LA im Vergleich zu BN eine erhöhte und 18 eine verringerte Aktivität (Abb. 2c).
Workflow zur Erstellung eines Klassifikators für Lungenrundherde, einschließlich der Auswahl des besten Panels von Serummetaboliten im Entdeckungsdatensatz mittels eines binären logistischen Regressionsmodells durch zehnfache Kreuzvalidierung und Bewertung der Vorhersageleistung in internen und externen Validierungsdatensätzen. b Kreuzvalidierungsstatistik des LASSO-Regressionsmodells zur Auswahl metabolischer Biomarker. Die oben angegebenen Zahlen stellen die durchschnittliche Anzahl der bei einem gegebenen λ ausgewählten Biomarker dar. Die rote gestrichelte Linie repräsentiert den durchschnittlichen AUC-Wert beim entsprechenden λ. Graue Fehlerbalken stellen die minimalen und maximalen AUC-Werte dar. Die gestrichelte Linie zeigt das beste Modell mit den 27 ausgewählten Biomarkern. AUC: Fläche unter der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic). c Änderungen der Expression von 27 ausgewählten Metaboliten in der LA-Gruppe im Vergleich zur BN-Gruppe im Entdeckungsdatensatz. Rote Säule: Aktivierung. Blaue Säule: Abfall. d–f ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) zeigen die Leistungsfähigkeit des Diskriminanzmodells anhand von 27 Metabolitkombinationen in den Datensätzen zur Entdeckung, internen und externen Validierung. Die Quelldaten liegen als Quelldateien vor.
Basierend auf den gewichteten Regressionskoeffizienten dieser 27 Metaboliten wurde ein Vorhersagemodell erstellt (Ergänzungstabelle 3). Die ROC-Analyse dieser 27 Metaboliten ergab eine Fläche unter der Kurve (AUC) von 0,933, eine Sensitivität von 0,868 und eine Spezifität von 0,859 (Abb. 2d). Von den 38 annotierten differentiellen Metaboliten zwischen LA und HC erreichte ein Satz von 16 Metaboliten eine AUC von 0,902 mit einer Sensitivität von 0,801 und einer Spezifität von 0,856 bei der Unterscheidung von LA und HC (Ergänzungsabbildung 6a–c). Die AUC-Werte basierend auf verschiedenen Schwellenwerten für die Faltänderung der differentiellen Metaboliten wurden ebenfalls verglichen. Wir stellten fest, dass das Klassifikationsmodell die beste Unterscheidung zwischen LA und BN (HC) ermöglichte, wenn der Fold-Change-Wert auf 1,2 anstatt 1,5 oder 2,0 festgelegt wurde (Ergänzende Abbildung 7a,b). Das auf 27 Metabolitgruppen basierende Klassifikationsmodell wurde in internen und externen Kohorten validiert. Die AUC betrug 0,915 (Sensitivität 0,867, Spezifität 0,811) für die interne Validierung und 0,945 (Sensitivität 0,810, Spezifität 0,979) für die externe Validierung (Abb. 2e,f). Zur Beurteilung der Interlabor-Effizienz wurden 40 Proben der externen Kohorte in einem externen Labor analysiert (siehe Methoden). Die Klassifikationsgenauigkeit erreichte eine AUC von 0,925 (Ergänzende Abbildung 8). Da das Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC) nach dem Lungenadenokarzinom (LUAD) der zweithäufigste Subtyp des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) ist, untersuchten wir auch den validierten potenziellen Nutzen metabolischer Profile. Wir verglichen BN mit 16 LUSC-Fällen. Die AUC zur Unterscheidung zwischen LUSC und BN betrug 0,776 (Ergänzende Abbildung 9), was auf eine geringere Unterscheidungsfähigkeit im Vergleich zur Unterscheidung zwischen LUAD und BN hindeutet.
Studien haben gezeigt, dass die Größe von Lungenrundherden in CT-Bildern positiv mit der Wahrscheinlichkeit einer Malignität korreliert und weiterhin ein wichtiger Faktor für die Behandlung von Lungenrundherden ist25,26,27. Die Analyse von Daten der großen Kohorte der NELSON-Screening-Studie zeigte, dass das Malignitätsrisiko bei Personen mit Lymphknoten < 5 mm sogar ähnlich hoch war wie bei Personen ohne Lymphknoten28. Daher beträgt die Mindestgröße, ab der regelmäßige CT-Kontrollen erforderlich sind, 5 mm (Empfehlung der British Thoracic Society, BTS) bzw. 6 mm (Empfehlung der Fleischner Society)29. Allerdings stellen Lungenrundherde mit einem Durchmesser von mehr als 6 mm und ohne eindeutige benigne Merkmale, sogenannte unbestimmte Lungenrundherde (IPN), weiterhin eine große Herausforderung in der klinischen Praxis dar30,31. Anschließend untersuchten wir anhand gepoolter Proben aus der Entdeckungs- und der internen Validierungskohorte, ob die Größe der Lungenrundherde die metabolomischen Signaturen beeinflusst. Anhand von 27 validierten Biomarkern verglichen wir zunächst die PCA-Profile der Metabolome von gesunden Kontrollpersonen (HC) und benignen Tumoren (BN) mit einem Durchmesser von unter 6 mm. Wir stellten fest, dass sich die meisten Datenpunkte für HC und BN überschnitten, was auf ähnliche Serummetabolitspiegel in beiden Gruppen hindeutet (Abb. 3a). Die Merkmalskarten über verschiedene Größenbereiche hinweg blieben in BN und LA erhalten (Abb. 3b, c), während im Bereich von 6–20 mm eine Trennung zwischen malignen und benignen Knoten beobachtet wurde (Abb. 3d). Diese Kohorte erreichte eine AUC von 0,927, eine Spezifität von 0,868 und eine Sensitivität von 0,820 für die Vorhersage der Malignität von Knoten mit einem Durchmesser von 6 bis 20 mm (Abb. 3e, f). Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Klassifikator metabolische Veränderungen, die durch eine frühe maligne Transformation verursacht werden, unabhängig von der Knotengröße erfassen kann.
a) Vergleich der PCA-Profile zwischen den Gruppen basierend auf einem metabolischen Klassifikator mit 27 Metaboliten. CC und BN < 6 mm. b) BN < 6 mm vs. BN 6–20 mm. in LA 6–20 mm vs. LA 20–30 mm. g) BN 6–20 mm und LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e) ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) zur Darstellung der Diskriminanzmodellleistung für Knoten mit einem Durchmesser von 6–20 mm. f) Die Wahrscheinlichkeitswerte wurden basierend auf dem logistischen Regressionsmodell für Knoten mit einem Durchmesser von 6–20 mm berechnet. Die graue gestrichelte Linie stellt den optimalen Schwellenwert (0,455) dar. Die obigen Zahlen geben den prozentualen Anteil der für Los Angeles prognostizierten Fälle an. Verwenden Sie einen zweiseitigen t-Test nach Student. PCA: Hauptkomponentenanalyse. AUC: Fläche unter der Kurve. Die Quelldaten werden als Quelldateien bereitgestellt.
Vier weitere Proben (im Alter von 44–61 Jahren) mit ähnlichen Lungenrundherden (7–9 mm) wurden ausgewählt, um die Leistungsfähigkeit des vorgeschlagenen Malignitätsvorhersagemodells zu veranschaulichen (Abb. 4a, b). Fall 1 präsentierte sich bei der Erstuntersuchung als solider Rundherd mit Verkalkungen, ein Merkmal, das mit Gutartigkeit assoziiert ist, während Fall 2 einen unklaren, teilweise soliden Rundherd ohne eindeutige gutartige Merkmale aufwies. Drei Kontroll-CT-Untersuchungen zeigten, dass diese Fälle über einen Zeitraum von vier Jahren stabil blieben und daher als gutartige Rundherde eingestuft wurden (Abb. 4a). Im Vergleich zur klinischen Beurteilung von CT-Serienuntersuchungen identifizierte die Serummetabolitenanalyse mit dem vorliegenden Klassifikationsmodell diese gutartigen Rundherde schnell und korrekt anhand probabilistischer Kriterien (Tabelle 1). Abbildung 4b zeigt in Fall 3 einen Rundherd mit Anzeichen einer Pleuraretraktion, die meist mit Malignität assoziiert ist32. Fall 4 präsentierte sich als unklarer, teilweise solider Knoten ohne Anzeichen einer gutartigen Ursache. Alle diese Fälle wurden gemäß dem Klassifikationsmodell als maligne vorhergesagt (Tabelle 1). Die Diagnose eines Lungenadenokarzinoms wurde durch die histopathologische Untersuchung nach Lungenresektion bestätigt (Abb. 4b). Im externen Validierungsdatensatz sagte der metabolische Klassifikator zwei Fälle unklarer Lungenknoten mit einem Durchmesser von über 6 mm korrekt voraus (Ergänzende Abbildung 10).
CT-Aufnahmen der Lunge im axialen Fenster bei zwei Fällen gutartiger Lungenrundherde. Fall 1 zeigte die CT-Untersuchung nach 4 Jahren einen stabilen, soliden Rundherd von 7 mm Durchmesser mit Verkalkung im rechten Unterlappen. Fall 2 zeigte die CT-Untersuchung nach 5 Jahren einen stabilen, teilsoliden Rundherd von 7 mm Durchmesser im rechten Oberlappen. b) CT-Aufnahmen der Lunge im axialen Fenster und zugehörige pathologische Untersuchungen von zwei Fällen eines Adenokarzinoms im Stadium I vor Lungenresektion. Fall 3 zeigte einen Rundherd von 8 mm Durchmesser im rechten Oberlappen mit Pleuraeinziehung. Fall 4 zeigte einen teilsoliden Milchglasrundherd von 9 mm Durchmesser im linken Oberlappen. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E) des resezierten Lungengewebes (Maßstabsbalken = 50 μm) zeigt das azinäre Wachstumsmuster des Lungenadenokarzinoms. Pfeile markieren die in den CT-Bildern detektierten Rundherde. H&E-Bilder sind repräsentative Abbildungen von mehreren (>3) mikroskopischen Feldern, die vom Pathologen untersucht wurden.
Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse den potenziellen Wert von Serummetabolit-Biomarkern bei der Differenzialdiagnose von Lungenrundherden auf, die bei der Auswertung von CT-Screenings eine Herausforderung darstellen können.
Anhand eines validierten differenziellen Metabolitenpanels suchten wir nach biologischen Korrelaten wesentlicher Stoffwechselveränderungen. Die KEGG-Pathway-Anreicherung mittels MetaboAnalyst identifizierte sechs signifikant veränderte Stoffwechselwege zwischen den beiden Gruppen (LA vs. HC und LA vs. BN, adjustierter p-Wert ≤ 0,001, Effektstärke > 0,01). Diese Veränderungen waren durch Störungen im Pyruvat-, Tryptophan-, Niacin- und Nicotinamidstoffwechsel, der Glykolyse, des Citratzyklus und des Purinstoffwechsels charakterisiert (Abb. 5a). Anschließend führten wir gezielte Metabolomik-Analysen durch, um die wesentlichen Veränderungen mittels absoluter Quantifizierung zu bestätigen. Die Bestimmung gemeinsamer Metaboliten in den veränderten Stoffwechselwegen erfolgte mittels Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (QQQ) unter Verwendung authentischer Metabolitstandards. Die demografischen Merkmale der Zielstichprobe der Metabolomik-Studie sind in Tabelle S4 (im Anhang) aufgeführt. Übereinstimmend mit unseren globalen Metabolomik-Ergebnissen bestätigte die quantitative Analyse, dass Hypoxanthin und Xanthin, Pyruvat und Laktat in der LA-Gruppe im Vergleich zu den Gruppen BN und HC erhöht waren (Abb. 5b, c, p < 0,05). Zwischen den Gruppen BN und HC wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in diesen Metaboliten festgestellt.
KEGG-Pathway-Anreicherung signifikant unterschiedlicher Metaboliten in der LA-Gruppe im Vergleich zu den BN- und HC-Gruppen. Es wurde ein zweiseitiger Globaltest durchgeführt, und die p-Werte wurden mittels Holm-Bonferroni-Korrektur angepasst (korrigiertes p ≤ 0,001 und Effektstärke > 0,01). b–d Violin-Plots zeigen die mittels LC-MS/MS bestimmten Hypoxanthin-, Xanthin-, Laktat-, Pyruvat- und Tryptophan-Konzentrationen im Serum von HC, BN und LA (n = 70 pro Gruppe). Weiße und schwarze gestrichelte Linien markieren Median bzw. Quartile. e Violin-Plot zeigt die normalisierte Log2TPM-mRNA-Expression (Transkripte pro Million) von SLC7A5 und QPRT in Lungenadenokarzinomen (n = 513) im Vergleich zu normalem Lungengewebe (n = 59) im LUAD-TCGA-Datensatz. Der weiße Kasten repräsentiert den Interquartilsabstand, die horizontale schwarze Linie in der Mitte den Median und die vertikale schwarze Linie, die vom Kasten ausgeht, das 95%-Konfidenzintervall (KI). f Pearson-Korrelationsdiagramm der SLC7A5- und GAPDH-Expression in Lungenadenokarzinomen (n = 513) und normalem Lungengewebe (n = 59) im TCGA-Datensatz. Der graue Bereich repräsentiert das 95%-KI. r, Pearson-Korrelationskoeffizient. g Normalisierte zelluläre Tryptophanspiegel in A549-Zellen, die mit unspezifischer shRNA-Kontrolle (NC) und shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfiziert wurden, bestimmt mittels LC-MS/MS. Es wird die statistische Analyse von fünf biologisch unabhängigen Proben pro Gruppe dargestellt. h Zelluläre NADt-Spiegel (Gesamt-NAD, einschließlich NAD+ und NADH) in A549-Zellen (NC) und SLC7A5-Knockdown-A549-Zellen (Sh1, Sh2). Es wird eine statistische Analyse von drei biologisch unabhängigen Proben pro Gruppe präsentiert. i Die glykolytische Aktivität von A549-Zellen vor und nach SLC7A5-Knockdown wurde mittels extrazellulärer Azidifizierungsrate (ECAR) gemessen (n = 4 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe). 2-DG, 2-Desoxy-D-Glucose. In (b–h) wurde der zweiseitige t-Test nach Student verwendet. In (g–i) stellen die Fehlerbalken den Mittelwert ± Standardabweichung dar. Jedes Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander durchgeführt, und die Ergebnisse waren vergleichbar. Die Quelldaten sind als Quelldateien verfügbar.
Angesichts der signifikanten Auswirkungen des veränderten Tryptophanstoffwechsels in der LA-Gruppe untersuchten wir mittels QQQ auch die Serumtryptophanspiegel in den Gruppen HC, BN und LA. Wir stellten fest, dass der Serumtryptophanspiegel in der LA-Gruppe im Vergleich zu HC oder BN reduziert war (p < 0,001, Abbildung 5d). Dies deckt sich mit früheren Befunden, die niedrigere zirkulierende Tryptophanspiegel bei Lungenkrebspatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen der Kontrollgruppe zeigten33,34,35. Eine weitere Studie mit dem PET/CT-Tracer 11C-Methyl-L-Tryptophan ergab eine signifikant erhöhte Tryptophan-Signalretentionszeit im Lungenkrebsgewebe im Vergleich zu benignen Läsionen oder normalem Gewebe36. Wir vermuten, dass der Abfall des Tryptophanspiegels im Serum der LA-Gruppe eine aktive Tryptophanaufnahme durch Lungenkrebszellen widerspiegelt.
Es ist außerdem bekannt, dass das Endprodukt des Kynurenin-Stoffwechselwegs des Tryptophan-Abbaus NAD+ ist37,38, welches ein wichtiges Substrat für die Reaktion von Glycerinaldehyd-3-phosphat mit 1,3-Bisphosphoglycerat in der Glykolyse darstellt39. Während sich frühere Studien auf die Rolle des Tryptophan-Abbaus in der Immunregulation konzentrierten, untersuchten wir in der vorliegenden Studie das Zusammenspiel zwischen Tryptophan-Dysregulation und glykolytischen Stoffwechselwegen. Das Protein SLC7A5 (Solute Transporter Family 7 Member 5) ist als Tryptophan-Transporter bekannt43,44,45. Die Chinolinsäure-Phosphoribosyltransferase (QPRT) ist ein Enzym, das nachgeschaltet im Kynurenin-Stoffwechselweg Chinolinsäure in NAMN umwandelt46. Die Analyse des LUAD-TCGA-Datensatzes ergab, dass sowohl SLC7A5 als auch QPRT im Tumorgewebe im Vergleich zu normalem Gewebe signifikant hochreguliert waren (Abb. 5e). Dieser Anstieg wurde in den Stadien I und II sowie III und IV des Lungenadenokarzinoms beobachtet (Ergänzende Abbildung 11), was auf frühe Störungen des Tryptophanstoffwechsels im Zusammenhang mit der Tumorentstehung hindeutet.
Darüber hinaus zeigte der LUAD-TCGA-Datensatz eine positive Korrelation zwischen der mRNA-Expression von SLC7A5 und GAPDH in Proben von Krebspatienten (r = 0,45, p = 1,55E-26, Abb. 5f). Im Gegensatz dazu wurde in normalem Lungengewebe keine signifikante Korrelation zwischen diesen Genexpressionsmustern gefunden (r = 0,25, p = 0,06, Abb. 5f). Die Herunterregulierung von SLC7A5 (Ergänzende Abb. 12) in A549-Zellen reduzierte signifikant die zellulären Tryptophan- und NAD(H)-Spiegel (Abb. 5g,h), was zu einer verminderten glykolytischen Aktivität, gemessen anhand der extrazellulären Azidifizierungsrate (ECAR), führte (Abb. 1, 5i). Basierend auf den metabolischen Veränderungen im Serum und den In-vitro-Nachweisen vermuten wir daher, dass der Tryptophanstoffwechsel NAD+ über den Kynureninweg produziert und eine wichtige Rolle bei der Förderung der Glykolyse in Lungenkrebs spielt.
Studien haben gezeigt, dass eine große Anzahl unklarer Lungenrundherde, die mittels LDCT entdeckt werden, zu zusätzlichen Untersuchungen wie PET-CT, Lungenbiopsie und Überbehandlung aufgrund einer falsch-positiven Malignitätsdiagnose führen kann.31 Wie in Abbildung 6 dargestellt, identifizierte unsere Studie ein Panel von Serummetaboliten mit potenziellem diagnostischem Wert, das die Risikostratifizierung und das anschließende Management von mittels CT entdeckten Lungenrundherden verbessern kann.
Lungenrundherde werden mittels Niedrigdosis-Computertomographie (LDCT) beurteilt. Die Bildgebung kann Hinweise auf gutartige oder bösartige Ursachen liefern. Die unsichere Prognose kann häufige Kontrolluntersuchungen, unnötige Eingriffe und Übertherapie zur Folge haben. Die Einbeziehung von Serum-Stoffwechselparametern mit diagnostischem Wert kann die Risikobewertung und das weitere Management von Lungenrundherden verbessern. PET (Positronen-Emissions-Tomographie) ist ein weiterer Ansatzpunkt.
Daten der US-amerikanischen NLST-Studie und der europäischen NELSON-Studie deuten darauf hin, dass das Screening von Hochrisikogruppen mittels Niedrigdosis-Computertomographie (LDCT) die Lungenkrebssterblichkeit senken kann1,3. Die Risikobewertung und das anschließende klinische Management der großen Anzahl zufällig entdeckter Lungenrundherde mittels LDCT stellen jedoch weiterhin die größte Herausforderung dar. Hauptziel ist die Optimierung der korrekten Klassifizierung bestehender LDCT-basierter Protokolle durch die Einbeziehung zuverlässiger Biomarker.
Bestimmte molekulare Biomarker, wie z. B. Blutmetaboliten, wurden durch den Vergleich von Lungenkrebs mit gesunden Kontrollgruppen identifiziert15,17. In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns auf die Anwendung der Serummetabolomanalyse zur Unterscheidung zwischen benignen und malignen Lungenrundherden, die zufällig mittels Niedrigdosis-Computertomographie (LDCT) entdeckt wurden. Wir verglichen das globale Serummetabolom von gesunden Kontrollpersonen (HC), benignen Lungenrundherden (BN) und Adenokarzinomen der Lunge im Stadium I (LA) mittels UPLC-HRMS-Analyse. Wir stellten fest, dass HC und BN ähnliche metabolische Profile aufwiesen, während LA signifikante Veränderungen im Vergleich zu HC und BN zeigte. Wir identifizierten zwei Gruppen von Serummetaboliten, die LA von HC und BN unterscheiden.
Das derzeitige LDCT-basierte Schema zur Identifizierung benigner und maligner Lungenrundherde stützt sich hauptsächlich auf deren Größe, Dichte, Morphologie und Wachstumsrate im Zeitverlauf30. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Größe von Lungenrundherden eng mit der Wahrscheinlichkeit für Lungenkrebs korreliert. Selbst bei Hochrisikopatienten liegt das Malignitätsrisiko bei Knoten < 6 mm unter 1 %. Das Malignitätsrisiko für Knoten mit einem Durchmesser von 6 bis 20 mm variiert zwischen 8 % und 64 %30. Daher empfiehlt die Fleischner Society einen Grenzwert von 6 mm für die routinemäßige CT-Nachsorge.29 Die Risikobewertung und das Management unklarer Lungenrundherde (IPN) mit einem Durchmesser von mehr als 6 mm sind jedoch unzureichend.31 Die aktuelle Behandlung angeborener Herzfehler basiert in der Regel auf abwartendem Beobachten mit engmaschiger CT-Kontrolle.
Basierend auf dem validierten Metabolom konnten wir erstmals die Überlappung metabolomischer Signaturen zwischen gesunden Personen und benignen Knoten < 6 mm nachweisen. Die biologische Ähnlichkeit deckt sich mit früheren CT-Befunden, die zeigen, dass das Malignitätsrisiko bei Knoten < 6 mm genauso gering ist wie bei Personen ohne Knoten.30 Unsere Ergebnisse belegen zudem eine hohe Ähnlichkeit der metabolomischen Profile benigner Knoten < 6 mm und ≥ 6 mm, was darauf hindeutet, dass die funktionelle Definition einer benignen Ätiologie unabhängig von der Knotengröße konsistent ist. Moderne diagnostische Serum-Metaboliten-Panels könnten daher als Ausschlusskriterium dienen, wenn Knoten initial im CT detektiert werden, und potenziell serielle Kontrollen reduzieren. Gleichzeitig konnte dasselbe Panel metabolischer Biomarker maligne Knoten ≥ 6 mm von benignen Knoten unterscheiden und präzise Vorhersagen für intraduktale pulmonale Neoplasien (IPN) ähnlicher Größe und mit uneindeutigen morphologischen Merkmalen im CT ermöglichen. Dieser Serummetabolismus-Klassifikator zeigte eine gute Vorhersagekraft für die Malignität von Knoten ≥ 6 mm mit einer AUC von 0,927. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass spezifische Serummetabolom-Signaturen frühe tumorinduzierte Stoffwechselveränderungen widerspiegeln und unabhängig von der Knotengröße potenziell als Risikoprädiktoren wertvoll sein können.
Lungenadenokarzinom (LUAD) und Plattenepithelkarzinom (LUSC) sind die Haupttypen des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC). Da LUSC stark mit Tabakkonsum assoziiert ist47 und LUAD die häufigste Histologie zufällig entdeckter Lungenrundherde im Rahmen von CT-Screenings darstellt48, wurde unser Klassifikationsmodell speziell für Adenokarzinomproben im Stadium I entwickelt. Wang et al. konzentrierten sich ebenfalls auf LUAD und identifizierten mithilfe der Lipidomik neun Lipidsignaturen, um Lungenkrebs im Frühstadium von gesunden Personen zu unterscheiden17. Wir testeten das vorliegende Klassifikationsmodell an 16 Fällen von LUSC im Stadium I und 74 benignen Rundherden und beobachteten eine geringe Vorhersagegenauigkeit für LUSC (AUC 0,776), was darauf hindeutet, dass LUAD und LUSC möglicherweise jeweils eigene metabolomische Signaturen aufweisen. Tatsächlich unterscheiden sich LUAD und LUSC nachweislich in Ätiologie, biologischem Ursprung und genetischen Aberrationen49. Daher sollten auch andere Arten der Histologie in Trainingsmodelle für die populationsbasierte Erkennung von Lungenkrebs in Screening-Programmen einbezogen werden.
Hier identifizierten wir die sechs am häufigsten veränderten Stoffwechselwege bei Lungenadenokarzinom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen und benignen Lungenrundherden. Xanthin und Hypoxanthin sind häufige Metaboliten des Purinstoffwechsels. Übereinstimmend mit unseren Ergebnissen waren Zwischenprodukte des Purinstoffwechsels im Serum und Gewebe von Patienten mit Lungenadenokarzinom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen oder Patienten im präinvasiven Stadium signifikant erhöht15,50. Erhöhte Serumspiegel von Xanthin und Hypoxanthin könnten den Anabolismus widerspiegeln, der von schnell proliferierenden Krebszellen benötigt wird. Eine Dysregulation des Glukosestoffwechsels ist ein bekanntes Kennzeichen des Krebsstoffwechsels51. Hier beobachteten wir einen signifikanten Anstieg von Pyruvat und Laktat in der LA-Gruppe im Vergleich zur HC- und BN-Gruppe, was mit früheren Berichten über Anomalien des glykolytischen Stoffwechselwegs im Serummetabolom von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) und gesunden Kontrollpersonen übereinstimmt. Die Ergebnisse sind konsistent52,53.
Wichtig ist, dass wir eine inverse Korrelation zwischen Pyruvat- und Tryptophanstoffwechsel im Serum von Lungenadenokarzinomen beobachteten. Die Serumtryptophanspiegel waren in der LA-Gruppe im Vergleich zur HC- oder BN-Gruppe reduziert. Interessanterweise zeigte eine frühere groß angelegte Studie mit einer prospektiven Kohorte, dass niedrige zirkulierende Tryptophanspiegel mit einem erhöhten Lungenkrebsrisiko assoziiert sind54. Tryptophan ist eine essentielle Aminosäure, die wir ausschließlich über die Nahrung aufnehmen. Wir schließen daraus, dass die Serumtryptophanverarmung bei Lungenadenokarzinomen einen raschen Verbrauch dieses Metaboliten widerspiegeln könnte. Es ist bekannt, dass das Endprodukt des Tryptophanabbaus über den Kynureninweg die Quelle der De-novo-NAD+-Synthese ist. Da NAD+ primär über den Salvage-Pathway produziert wird, ist die Bedeutung von NAD+ im Tryptophanstoffwechsel für Gesundheit und Krankheit noch nicht vollständig geklärt46. Unsere Analyse der TCGA-Datenbank zeigte, dass die Expression des Tryptophan-Transporters SLC7A5 in Lungenadenokarzinomen im Vergleich zu gesundem Gewebe signifikant erhöht war und positiv mit der Expression des glykolytischen Enzyms GAPDH korrelierte. Bisherige Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf die Rolle des Tryptophan-Abbaus bei der Suppression der Antitumor-Immunantwort40,41,42. Wir zeigen hier, dass die Hemmung der Tryptophan-Aufnahme durch Knockdown von SLC7A5 in Lungenkrebszellen zu einem nachfolgenden Abfall des zellulären NAD-Spiegels und einer damit einhergehenden Abschwächung der glykolytischen Aktivität führt. Zusammenfassend liefert unsere Studie eine biologische Grundlage für die mit der malignen Transformation von Lungenadenokarzinomen assoziierten Veränderungen im Serumstoffwechsel.
EGFR-Mutationen sind die häufigsten Treibermutationen bei Patienten mit NSCLC. In unserer Studie fanden wir, dass Patienten mit EGFR-Mutation (n = 41) insgesamt ähnliche Metabolomprofile aufwiesen wie Patienten mit EGFR-Wildtyp (n = 31). Allerdings beobachteten wir bei einigen EGFR-mutierten Patienten erniedrigte Serumspiegel von Acylcarnitin. Acylcarnitine transportieren Acylgruppen aus dem Zytoplasma in die mitochondriale Matrix, was zur Oxidation von Fettsäuren und damit zur Energiegewinnung führt55. Übereinstimmend mit unseren Ergebnissen identifizierte eine kürzlich durchgeführte Studie ähnliche Metabolomprofile zwischen EGFR-mutierten und EGFR-Wildtyp-Tumoren durch die Analyse des Gesamtmetaboloms von 102 Lungenadenokarzinom-Gewebeproben50. Interessanterweise wurde auch in der EGFR-mutierten Gruppe Acylcarnitin nachgewiesen. Daher ist es für weitere Untersuchungen relevant, ob Veränderungen der Acylcarnitinspiegel EGFR-induzierte metabolische Veränderungen und die zugrunde liegenden molekularen Signalwege widerspiegeln.
Zusammenfassend etabliert unsere Studie einen Serum-Metabolismus-Klassifikator für die Differenzialdiagnose von Lungenrundherden und schlägt einen Arbeitsablauf vor, der die Risikobewertung optimieren und das klinische Management auf der Grundlage des CT-Scan-Screenings erleichtern kann.
Diese Studie wurde von den Ethikkommissionen des Krebskrankenhauses der Sun-Yat-sen-Universität, des Ersten Universitätsklinikums der Sun-Yat-sen-Universität und des Krebskrankenhauses der Zhengzhou-Universität genehmigt. In der Entdeckungs- und der internen Validierungsgruppe wurden 174 Serumproben von gesunden Probanden und 244 Serumproben von Patienten mit gutartigen Lungenknoten im Rahmen ihrer jährlichen Vorsorgeuntersuchungen in der Abteilung für Krebskontrolle und -prävention des Krebszentrums der Sun-Yat-sen-Universität sowie 166 Serumproben von Patienten mit gutartigen Lungenknoten im Stadium I aus dem Krebszentrum der Sun-Yat-sen-Universität gesammelt. Die externe Validierungskohorte umfasste 48 Fälle von gutartigen Lungenknoten, 39 Fälle von Lungenadenokarzinomen im Stadium I aus dem Ersten Universitätsklinikum der Sun-Yat-sen-Universität und 24 Fälle von Lungenadenokarzinomen im Stadium I aus dem Krebskrankenhaus Zhengzhou. Das Krebszentrum der Sun-Yat-sen-Universität sammelte außerdem 16 Fälle von Plattenepithelkarzinom der Lunge im Stadium I, um die diagnostische Leistungsfähigkeit des etablierten metabolischen Klassifikators zu testen (Patientenmerkmale siehe Ergänzungstabelle 5). Die Proben der Entdeckungskohorte und der internen Validierungskohorte wurden zwischen Januar 2018 und Mai 2020 gesammelt. Die Proben der externen Validierungskohorte wurden zwischen August 2021 und Oktober 2022 gesammelt. Um geschlechtsspezifische Verzerrungen zu minimieren, wurde jeder Kohorte eine annähernd gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fälle zugeordnet. Entdeckungsteam und internes Prüfteam. Das Geschlecht der Teilnehmenden wurde anhand ihrer Selbstauskunft ermittelt. Alle Teilnehmenden gaben ihre Einwilligung nach Aufklärung; es wurde keine Vergütung gezahlt. Personen mit gutartigen Knoten wiesen zum Zeitpunkt der Analyse einen stabilen CT-Scan-Score über einen Zeitraum von 2 bis 5 Jahren auf, mit Ausnahme eines Falls aus der externen Validierungsstichprobe, der präoperativ entnommen und histopathologisch diagnostiziert wurde. Ausgenommen hiervon war die chronische Bronchitis. Fälle von Lungenadenokarzinom wurden vor der Lungenresektion gesammelt und pathologisch bestätigt. Nüchternblutproben wurden in Serumseparationsröhrchen ohne Antikoagulanzien entnommen. Die Blutproben wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur gerinnen gelassen und anschließend 10 Minuten bei 4 °C und 2851 × g zentrifugiert, um den Serumüberstand zu gewinnen. Serumaliquots wurden bis zur Metabolitenextraktion bei -80 °C eingefroren. Die Abteilung für Krebsprävention und medizinische Untersuchung des Krebszentrums der Sun-Yat-sen-Universität sammelte ein Serum-Pool von 100 gesunden Spendern, darunter jeweils eine gleiche Anzahl von Männern und Frauen im Alter von 40 bis 55 Jahren. Gleiche Volumina der Proben jedes Spenders wurden gemischt, der resultierende Pool aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Die Serummischung diente als Referenzmaterial für die Qualitätskontrolle und Datenstandardisierung.
Referenzserum und Testproben wurden aufgetaut und die Metaboliten mittels einer kombinierten Extraktionsmethode (MTBE/Methanol/Wasser) extrahiert56. Kurz gesagt, wurden 50 μl Serum mit 225 μl eiskaltem Methanol und 750 μl eiskaltem Methyl-tert-butylether (MTBE) vermischt. Die Mischung wurde gerührt und 1 Stunde auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit 188 μl MS-Wasser, das interne Standards (13C-Lactat, 13C-3-Pyruvat, 13C-Methionin und 13C-6-Isoleucin, bezogen von Cambridge Isotope Laboratories) enthielt, vermischt und vortexiert. Die Mischung wurde dann 10 min bei 15.000 × g und 4 °C zentrifugiert, und die untere Phase wurde für die LC-MS-Analyse im positiven und negativen Modus in zwei Röhrchen (je 125 μl) überführt. Abschließend wurde die Probe in einem Hochgeschwindigkeits-Vakuumkonzentrator zur Trockne eingedampft.
Die getrockneten Metaboliten wurden in 120 μl 80%igem Acetonitril gelöst, 5 min lang vortexiert und anschließend 10 min bei 15.000 × g und 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden für die Metabolomik-Analyse in Braunglasfläschchen mit Mikroeinsätzen überführt. Die ungerichtete Metabolomanalyse erfolgte mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Hochauflösungs-Massenspektrometrie (UPLC-HRMS). Die Trennung der Metaboliten erfolgte mit einem Dionex Ultimate 3000 UPLC-System und einer ACQUITY BEH Amide-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Im Positivionenmodus bestanden die mobilen Phasen aus 95 % (A) und 50 % (B) Acetonitril, jeweils mit 10 mmol/l Ammoniumacetat und 0,1 % Ameisensäure. Im Negativmodus enthielten die mobilen Phasen A und B 95 % bzw. 50 % Acetonitril. Beide Phasen enthielten 10 mmol/L Ammoniumacetat (pH = 9). Das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–0,5 min, 2 % B; 0,5–12 min, 2–50 % B; 12–14 min, 50–98 % B; 14–16 min, 98 % B; 16–16,1 min, 98–2 % B; 16,1–20 min, 2 % B. Die Säule wurde im Autosampler auf 40 °C und die Probe auf 10 °C temperiert. Die Flussrate betrug 0,3 ml/min, das Injektionsvolumen 3 μl. Ein Q-Exactive Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) mit Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) wurde im Full-Scan-Modus betrieben und mit dem ddMS2-Monitoring-Modus gekoppelt, um große Datenmengen zu erfassen. Die MS-Parameter waren wie folgt eingestellt: Sprühspannung +3,8 kV/-3,2 kV, Kapillartemperatur 320 °C, Schutzgas 40 arb, Hilfsgas 10 arb, Sondenheizertemperatur 350 °C, Scanbereich 70–1050 m/h, Auflösung 70.000. Die Datenerfassung erfolgte mit Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Zur Beurteilung der Datenqualität wurden gepoolte Qualitätskontrollproben (QC-Proben) erstellt, indem jeweils 10 μL Überstand aus jeder Probe entnommen wurden. Zu Beginn der Analysesequenz wurden sechs QC-Proben injiziert, um die Stabilität des UPLC-MS-Systems zu überprüfen. Anschließend wurden regelmäßig QC-Proben in den jeweiligen Batch eingeführt. Alle elf Serumproben-Batches dieser Studie wurden mittels LC-MS analysiert. Aliquots eines Serum-Pools von 100 gesunden Spendern dienten in den jeweiligen Batches als Referenzmaterial, um den Extraktionsprozess zu überwachen und Batch-Effekte zu korrigieren. Die ungerichtete Metabolomanalyse der Entdeckungskohorte, der internen Validierungskohorte und der externen Validierungskohorte wurde am Metabolomics Center der Sun Yat-sen Universität durchgeführt. Das externe Labor des Analyse- und Testzentrums der Guangdong University of Technology analysierte zudem 40 Proben der externen Kohorte, um die Leistungsfähigkeit des Klassifikationsmodells zu testen.
Nach Extraktion und Rekonstitution erfolgte die absolute Quantifizierung der Serummetaboliten mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (Agilent 6495 Triple-Quadrupol) mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) im Multiple-Reaction-Monitoring-Modus (MRM). Zur Trennung der Metaboliten wurde eine ACQUITY BEH Amide-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) verwendet. Die mobile Phase bestand aus 90 % (A) und 5 % Acetonitril (B) mit 10 mmol/L Ammoniumacetat und 0,1 % Ammoniaklösung. Das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–1,5 min, 0 % B; 1,5–6,5 min, 0–15 % B; 6,5–8 min, 15 % B; 8–8,5 min, 15–0 % B; 8,5–11,5 min, 0 % B. Die Säule wurde im Autosampler auf 40 °C und die Probe auf 10 °C temperiert. Die Flussrate betrug 0,3 ml/min und das Injektionsvolumen 1 μl. Die MS-Parameter waren wie folgt eingestellt: Kapillarspannung ±3,5 kV, Zerstäuberdruck 35 psi, Mantelgasfluss 12 l/min, Mantelgastemperatur 350 °C, Trockengastemperatur 250 °C und Trockengasfluss 14 l/min. Die MRM-Konversionen von Tryptophan, Pyruvat, Lactat, Hypoxanthin und Xanthin lagen bei 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 bzw. 151,0–107,9. Die Datenerfassung erfolgte mit MassHunter B.07.00 (Agilent Technologies). In Serumproben wurden Tryptophan, Pyruvat, Laktat, Hypoxanthin und Xanthin mithilfe von Kalibrierkurven mit Standardlösungen quantifiziert. In Zellproben wurde der Tryptophangehalt auf den internen Standard und die Zellproteinmasse normiert.
Die Peak-Extraktion (m/z und Retentionszeit (RT)) erfolgte mit Compound Discovery 3.1 und TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Um potenzielle Chargenunterschiede zu eliminieren, wurde jeder charakteristische Peak der Testprobe durch den charakteristischen Peak des Referenzmaterials derselben Charge dividiert, um die relative Häufigkeit zu bestimmen. Die relativen Standardabweichungen der internen Standards vor und nach der Standardisierung sind in Tabelle S6 (Zusatzmaterial) dargestellt. Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden anhand der Falsch-Entdeckungsrate (FDR < 0,05, Wilcoxon-Vorzeichenrangtest) und der Fold Change (> 1,2 oder < 0,83) charakterisiert. Rohdaten der extrahierten Merkmale sowie die auf das Referenzserum korrigierten MS-Daten sind in den Zusatzdaten 1 bzw. 2 dargestellt. Die Peak-Annotation erfolgte anhand von vier definierten Identifikationsebenen: identifizierte Metaboliten, potenziell annotierte Verbindungen, potenziell charakterisierte Verbindungsklassen und unbekannte Verbindungen22. Basierend auf Datenbankrecherchen in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) wurden biologische Verbindungen mit MS/MS-Übereinstimmung mit validierten Standards oder exakten Übereinstimmungen in mzCloud (Score > 85) oder Chemspider als Zwischenprodukte des differentiellen Metaboloms ausgewählt. Peak-Annotationen für jedes Merkmal sind in den ergänzenden Daten 3 enthalten. MetaboAnalyst 5.0 wurde für die univariate Analyse der summennormalisierten Metabolitenhäufigkeit verwendet. MetaboAnalyst 5.0 evaluierte außerdem die KEGG-Pathway-Anreicherung basierend auf signifikant unterschiedlichen Metaboliten. Hauptkomponentenanalyse (PCA) und partielle Least-Squares-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) wurden mit dem Softwarepaket ropls (v.1.26.4) mit Stack-Normalisierung und Autoskalierung durchgeführt. Das optimale Metabolit-Biomarker-Modell zur Vorhersage der Malignität von Knoten wurde mittels binärer logistischer Regression mit Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO, R-Paket v.4.1-3) generiert. Die Leistungsfähigkeit des Diskriminanzmodells in den Detektions- und Validierungsdatensätzen wurde durch die Bestimmung der AUC auf Basis einer ROC-Analyse gemäß dem pROC-Paket (Version 1.18.0) charakterisiert. Der optimale Schwellenwert für die Wahrscheinlichkeit wurde anhand des maximalen Youden-Index des Modells (Sensitivität + Spezifität – 1) ermittelt. Proben mit Werten unterhalb bzw. oberhalb des Schwellenwerts werden als gutartige Knoten bzw. Lungenadenokarzinom vorhergesagt.
A549-Zellen (#CCL-185, American Type Culture Collection) wurden in F-12K-Medium mit 10 % FBS kultiviert. Kurze Haarnadel-RNA-Sequenzen (shRNA) gegen SLC7A5 und eine nicht-zielgerichtete Kontroll-shRNA (NC) wurden in den lentiviralen Vektor pLKO.1-puro kloniert. Die Antisense-Sequenzen von shSLC7A5 lauten: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antikörper gegen SLC7A5 (#5347) und Tubulin (#2148) wurden von Cell Signaling Technology bezogen. Für die Western-Blot-Analyse wurden die Antikörper gegen SLC7A5 und Tubulin in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet.
Der Seahorse XF Glykolyse-Stresstest misst den extrazellulären Azidifizierungsgrad (ECAR). Im Test wurden Glucose, Oligomycin A und 2-DG nacheinander verabreicht, um die zelluläre Glykolysekapazität anhand des ECAR-Wertes zu bestimmen.
A549-Zellen, die mit einer nicht-zielgerichteten Kontrolle (NC) und shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfiziert wurden, wurden über Nacht in 10-cm-Petrischalen ausgesät. Die Zellmetaboliten wurden mit 1 ml eiskaltem 80%igem wässrigem Methanol extrahiert. Die Zellen in der Methanollösung wurden abgeschabt, in ein neues Röhrchen überführt und 15 min bei 15.000 × g und 4 °C zentrifugiert. 800 µl des Überstands wurden abgenommen und mit einem Hochgeschwindigkeits-Vakuumkonzentrator getrocknet. Die getrockneten Metabolitpellets wurden anschließend mittels LC-MS/MS wie oben beschrieben auf ihren Tryptophangehalt analysiert. Der zelluläre NAD(H)-Gehalt in A549-Zellen (NC und shSLC7A5) wurde mit einem quantitativen NAD+/NADH-Farbtestkit (#K337, BioVision) gemäß den Herstellerangaben bestimmt. Der Proteingehalt jeder Probe wurde gemessen, um die Metabolitmenge zu normalisieren.
Zur vorläufigen Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden angewendet. Frühere Metabolomik-Studien zur Biomarker-Entdeckung15,18 dienten als Referenzwerte für die Stichprobengrößenbestimmung, und im Vergleich zu diesen Berichten war unsere Stichprobe ausreichend. Es wurden keine Proben aus der Studienkohorte ausgeschlossen. Serumproben wurden für ungerichtete Metabolomik-Studien randomisiert einer Entdeckungsgruppe (306 Fälle, 74,6 %) und einer internen Validierungsgruppe (104 Fälle, 25,4 %) zugeordnet. Zusätzlich wurden aus jeder Gruppe der Entdeckungsgruppe zufällig 70 Fälle für zielgerichtete Metabolomik-Studien ausgewählt. Die Untersucher waren während der LC-MS-Datenerfassung und -analyse hinsichtlich der Gruppenzuordnung verblindet. Statistische Analysen der Metabolomik-Daten und der Zellexperimente werden in den jeweiligen Abschnitten „Ergebnisse“, „Abbildungslegenden“ und „Methoden“ beschrieben. Die Quantifizierung von zellulärem Tryptophan, NADT und der glykolytischen Aktivität wurde dreimal unabhängig voneinander mit identischen Ergebnissen durchgeführt.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie im Abstract des Natural Portfolio Reports, das diesem Artikel beigefügt ist.
Die Rohdaten der extrahierten Merkmale und die normalisierten MS-Daten des Referenzserums sind in den ergänzenden Daten 1 bzw. 2 dargestellt. Peak-Annotationen für differentielle Merkmale finden sich in den ergänzenden Daten 3. Der LUAD-TCGA-Datensatz kann unter https://portal.gdc.cancer.gov/ heruntergeladen werden. Die Eingangsdaten für die Erstellung der Grafik sind in den Quelldaten enthalten. Die Quelldaten sind für diesen Artikel verfügbar.
National Lung Screening Study Group, etc. Reduzierung der Lungenkrebssterblichkeit durch Niedrigdosis-Computertomographie. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR und Prophet, PC. Lungenkrebs-Screening mittels Niedrigdosis-Spiral-CT: Ergebnisse der National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Reduzierung der Lungenkrebssterblichkeit durch volumetrisches CT-Screening in einer randomisierten Studie. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Veröffentlichungsdatum: 18. September 2023