CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ist eine Genomeditierungstechnik der dritten Generation, die mit ihren hohen Durchsatzraten die Welt revolutioniert hat. Sie wird zur Behandlung verschiedener biologischer Erkrankungen und Infektionen eingesetzt. Auch diverse Bakterien und andere Prokaryoten (wie Archaeen) verfügen über CRISPR/Cas9-Systeme zur Abwehr von Phagen. Es wurde berichtet, dass CRISPR/Cas9-basierte Strategien das Wachstum und die Progression von dreifach negativem Brustkrebs (TNBC) hemmen können, indem sie potenziell veränderte Resistenzgene, die Transkription und die epigenetische Regulation beeinflussen. Diese therapeutischen Interventionen könnten dazu beitragen, Herausforderungen wie die selbst bei TNBC beobachtete Arzneimittelresistenz zu bewältigen. Derzeit werden verschiedene Methoden verwendet, um CRISPR/Cas9 in Zielzellen einzuschleusen, darunter physikalische (Mikroinjektion, Elektroporation und hydrodynamische Verfahren), virale (adeno-assoziierte Viren und Lentiviren) und nicht-virale (Liposomen und Lipidnanopartikel). Obwohl verschiedene Modelle zur Erforschung der molekularen Ursachen von TNBC entwickelt wurden, schränkt der Mangel an sensitiven und zielgerichteten Methoden zur In-vivo-Applikation von Genomeditierungswerkzeugen deren klinische Anwendung ein. Zusammenfassend untersucht dieser Review umfassend die Fortschritte, Herausforderungen, Grenzen und Perspektiven der CRISPR/Cas9-Therapie bei TNBC auf Grundlage der vorliegenden Evidenz. Wir zeigen zudem auf, wie die Kombination von künstlicher Intelligenz und maschinellem Lernen die CRISPR/Cas9-Strategien in der TNBC-Therapie verbessern kann.
Krebs ist durch unkontrollierte Zellteilung, Störung der Zellzyklus-Kontrollpunkte und Mutationen in Tumorsuppressorgenen (TSGs) gekennzeichnet (Matthews et al., 2022). Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen und weist weltweit eine hohe Sterblichkeitsrate auf (Waks und Winer, 2019). Es handelt sich um eine heterogene Erkrankung mit vielfältigen Merkmalen, wie histologischen und biologischen Eigenschaften, klinischem Erscheinungsbild und Verlauf sowie Ansprechen auf die Behandlung (Weigelt et al., 2010). Die Klassifizierung von Brustkrebs ermöglicht präzise Erkenntnisse für die Diagnose und Prognose. Die Verwendung gängiger Biomarker und klinisch-pathologischer Merkmale ist das Hauptkriterium für die Klassifizierung von Brustkrebs (Tsang und Tse, 2019). Die Prognose und das Ansprechen auf die Behandlung von Brustkrebs werden von zahlreichen Faktoren beeinflusst, darunter das Vorhandensein von Östrogenrezeptoren (ER), Progesteronrezeptoren (PR), humanem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2/neu) sowie der histologische Grad, der Tumortyp, die Tumorgröße und Lymphknotenmetastasen (Al-Tubaiti, 2020). Fünf intrinsische molekulare Subtypen von Brustkrebs wurden identifiziert: luminal A, luminal B, HER2-positiv, basal-like und Claudin-low (Prat et al., 2015). TNBC ist ein molekularer Subtyp, der nicht alle ER, PR und HER2 exprimiert (Yin et al., 2020). Diese pathologischen Merkmale sind mit TNBC assoziiert und bestätigen dessen rasche Progression und aggressiveren Verlauf im Vergleich zu anderen Brustkrebsarten (Feng et al., 2018). Peru et al. (2000) nutzten die Microarray-Technologie, um Brustkrebs neu zu klassifizieren und fünf intrinsische Subtypen zu identifizieren (Cadenas, 2012). Basalzellartiger Brustkrebs ist ein Subtyp mit einem dreifach negativen Phänotyp und ist mit einer schnellen Progression assoziiert. Es ist anzumerken, dass alle basalzellartigen Brustkrebse häufig fälschlicherweise als TNBC diagnostiziert werden, obwohl nur 77 % davon tatsächlich TNBC sind. Im Gegensatz dazu sind 71–91 % der TNBC basalzellartig, was darauf hindeutet, dass sich diese beiden Brustkrebsarten überschneiden und unterschiedliche Klassifikationen darstellen (Wang D.-Y. et al., 2019). Dies unterstreicht die Notwendigkeit, die Heterogenität von TNBC zu charakterisieren, um die Prognose zu verbessern und potenzielle Reaktionen auf aktuelle und zukünftige Therapien zu identifizieren. TNBC macht 15–20 % aller Brustkrebsfälle aus und tritt häufiger bei Frauen unter 50 Jahren auf. BRCA1- oder BRCA2-Mutationen wurden in etwa 20 % der TNBC-Fälle beschrieben (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017; 2020). Studien haben zudem gezeigt, dass TNBC ein spezifisches Immunmikromilieu aufweist, das hohe Konzentrationen an vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren, tumorassoziierten Makrophagen (TAMs), tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) und anderen Molekülen umfasst, die am Tumorwachstum und der Tumormigration beteiligt sind. Daher ist das Verständnis des Mikromilieus von TNBC entscheidend für die Prognose und Behandlung (Fan und He, 2022).
Zur Beurteilung der Prognose von TNBC und zur Sicherstellung einer effektiven Behandlung ist eine präzise Diagnose, hauptsächlich basierend auf der Immunhistochemie (IHC) zum Nachweis von ER, PR und HER2 sowie der Mammographie zum Nachweis von Brusttumoren, von großer Bedeutung. Allerdings kann die Mammographie intratumorale Merkmale wie Nekrosen und Fibrosen nicht ausreichend darstellen (Deepak Singh et al., 2021). Da die ungünstige Prognose und die oft schwierige Diagnosestellung Ärzte daran hindern, die richtigen Medikamente zu verschreiben (Chaudhary, 2020), werden verschiedene Strategien zur Verbesserung der Versorgung von Patientinnen mit TNBC eingesetzt. Derzeit werden Doxorubicin und Cyclophosphamid bei Patientinnen mit TNBC angewendet und haben gute Ergebnisse gezeigt. Zusätzlich kommen weitere Platinpräparate wie Carboplatin und Cisplatin zum Einsatz (Sikov et al., 2015). Darüber hinaus wurden PARP-Inhibitoren wie Olaparib, Velaparib und PF-01367338 als potenzielle Chemotherapeutika zur Behandlung von TNBC eingesetzt (Ishino et al., 2018). Da die Wnt/β-Catenin-, NOTCH- und Hedgehog-Signalwege an der Entstehung und dem Fortschreiten von TNBC beteiligt sind, könnte die gezielte Beeinflussung dieser Signalwege eine wichtige Strategie darstellen (Aysola et al., 2013). Obwohl Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie nach wie vor die wichtigsten Behandlungsoptionen für TNBC darstellen, wurden bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung neuer Therapien erzielt, darunter zielgerichtete Therapien, Immuntherapien, verschiedene CRISPR-basierte Genomeditierungswerkzeuge wie Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, Prime Editing und CRISPR/Cas9-basierte Gentherapie. Im Folgenden konzentrieren wir uns auf verschiedene CRISPR-basierte Genomeditierungswerkzeuge, die in der Behandlung von TNBC Anwendung finden. Unter ihnen hat CRISPR/Cas9 weite Beachtung gefunden.
Cas9n, auch bekannt als Cas9-Nickase, ist eine gentechnisch veränderte Variante des Cas9-Proteins, das aus dem CRISPR/Cas9-Genomeditierungssystem stammt (Gupta et al., 2019). Das ursprüngliche Cas9-Protein besitzt zwei Nukleasedomänen: RuvC und HNH, deren Hauptfunktion die Spaltung beider DNA-Stränge ist. Bei Cas9n ist jedoch eine der Nukleasedomänen, HNH, genetisch mutiert und inaktiv. Daher bleibt die HNH-Domäne von Cas9n funktionslos. Nur die RuvC-Domäne ist aktiv und ermöglicht Cas9n das Schneiden oder Erzeugen von Brüchen in einzelnen DNA-Strängen (Trevino und Zhang, 2014). Im Vergleich zu Cas9 kann Cas9n Off-Target-Effekte effektiv reduzieren und zelluläre Reparaturmechanismen präzise verbessern. Cas9n kann zur Lösung verschiedener Probleme eingesetzt werden, beispielsweise zum Erzeugen von Brüchen an spezifischen Stellen in doppelsträngiger DNA. Zu diesem Zweck wurden zwei Cas9n-Moleküle kombiniert und gemeinsam verwendet (Yee, 2016). Die Mixed-Lineage-Kinase 3 (MLK3) ist eine mitogenaktivierte Proteinkinase, die als wichtiger Regulator bei der Metastasierung von TNBC dient (Cronan et al., 2012).
MLK3 kann mehrere Signalwege aktivieren, die zur Metastasierung von TNBC führen. Beispielsweise reguliert der c-Jun N-terminale Kinase (JNK)-Signalweg die Zellmotilität und den Abbau der extrazellulären Matrix. MLK3 aktiviert den JNK-Signalweg, wodurch die Zellmotilität gesteigert und invasive Eigenschaften verliehen werden (Rattanasinchai und Gallo, 2016). MLK3 reguliert auch die EMT. Dazu aktiviert es nachgeschaltete Transkriptionsfaktoren wie Snail, Slug und Twist. Diese Faktoren hemmen die Expression epithelialer Marker und fördern die Expression mesenchymaler Marker, was zur Ausbildung eines metastatischen Phänotyps führt (Casalino et al., 2023). MLK3 spielt nachweislich eine Rolle beim ECM-Remodeling und der Aktivierung von Proteasen wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die die ECM abbauen. Dies erleichtert die Invasion von Tumorzellen und deren Ausbreitung in entfernte Gewebe (Katari et al., 2019). Frühere Studien haben gezeigt, dass MLK3 eine entscheidende Rolle bei TNBC spielt. Rattanasinchai und Gallo untersuchten die Funktion von MLK3 anhand von TNBC-Modellen und fanden heraus, dass es die Krebsentwicklung über spezifische Signalwege fördert. Mithilfe von CRISPR/Cas9n editierten sie MLK3 und beobachteten eine signifikante Reduktion der TNBC-Metastasierung (Rattanasinchai und Gallo, 2016).
dCas9, oft auch inaktives Cas9 genannt, ist eine modifizierte Form des Cas9-Proteins. Im Gegensatz zu aktivem Cas9 besitzt dCas9 keine Endonukleaseaktivität und kann daher keine DNA-Doppelstrangbrüche induzieren. Aus diesem Grund kann dCas9 verwendet werden, um spezifische Genombereiche präzise zu adressieren, ohne die DNA-Sequenz zu verändern (Wang et al., 2016). In dCas9 sind die beiden Endonukleaseproteine RuvC und HNH durch die Unterdrückung wichtiger Aminosäurereste inaktiviert (Richter et al., 2016). Trotz seiner fehlenden DNA-Spaltungsaktivität spielt dCas9 eine Reihe wichtiger Rollen in der Genforschung und Biotechnologie. Beispielsweise ermöglicht es die Visualisierung spezifischer Genombereiche, erleichtert die Transkriptionsregulation und fördert epigenetische Modifikationen (Brocken et al., 2018).
Der Transkriptionsfaktor ZEB1 (Zinkfinger-E-Box-bindendes Homeobox-Protein 1) spielt eine spezifische und entscheidende Rolle bei der Vermittlung der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), einem zellulären Prozess, der während der Embryonalentwicklung, der Gewebereparatur und der Krebsentstehung auftritt. Er beinhaltet die Transformation von Epithelzellen in Mesenchymzellen, was zu Veränderungen der Zellmorphologie, Motilität, Invasivität usw. führt (Wu et al., 2020). ZEB1 hemmt mehrere Epithelmarker, wie E-Cadherin und Occludin, die für die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Adhäsion und Polarität von Epithelzellen bei TNBC verantwortlich sind (Moreno-Bueno et al., 2008). Darüber hinaus aktiviert ZEB1 bestimmte Marker wie N-Cadherin, Vimentin und Fibronektin (Konradi et al., 2014) und reguliert Gene, die am Zytoskelett-Umbau beteiligt sind, wie Rho-GTPasen und Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) (Huang et al., 2014). Zudem beeinflusst es verschiedene Signalwege wie den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) und den Wnt-Signalweg und fördert dadurch die Tumorinvasion und Metastasierung bei TNBC (Chen et al., 2016). Zahlreiche Studien und wissenschaftliche Erkenntnisse deuten darauf hin, dass ZEB1 großes Potenzial als wertvolles Agens für die Erkennung und therapeutische Intervention bei TNBC besitzt. In einer aktuellen Studie verwendeten Waryah et al. ein TNBC-Modell und erreichten eine vollständige Suppression von ZEB1 mittels dCas9. Sie beobachteten daher eine sehr hohe Spezifität und eine nahezu vollständige Hemmung von ZEB1 unter In-vivo-Bedingungen (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 ist ein Gen-Editing-Werkzeug, das aus dem CRISPR/Cpf1-System hervorgegangen ist. Cas12 steht für das CRISPR-assoziierte Protein 12 (Bharathkumar et al., 2022) und ist Cas9 sehr ähnlich. Der einzige Unterschied besteht darin, dass es das Cas12-Protein enthält. Im Vergleich zu Cas9 besitzt Cas12 einige einzigartige Funktionen, wie beispielsweise die Erzeugung von klebrigen Enden während des Gen-Editing-Prozesses, während Cas9 glatte Enden erzeugt (Wang et al., 2021). Diese Eigenschaft von Cas12 trägt zu seiner spezifischen DNA-Manipulationstechnologie bei. Als Protein, das Ziel-DNA präzise erkennen und schneiden kann, ist es äußerst vielseitig und somit ein effektives Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich des Gen-Editings (Pickar-Oliver und Gersbach, 2019).
Ähnlich wie andere CRISPR-Varianten kann auch CRISPR/Cas12 Gene in TNBC ausschalten oder aktivieren und dabei Gene anvisieren, die eine wichtige Rolle in der Pathogenese oder im Ansprechen auf die Behandlung spielen (Yang und Zhang, 2023). Hierfür wurde eine Leit-RNA (gRNA) entwickelt, die Cas12 zum Zielgen dirigiert. Sobald Cas12 an sein Ziel bindet, erzeugt es Doppelstrangbrüche in der DNA und aktiviert DNA-Reparaturmechanismen. Während des Reparaturprozesses können fehlerhafte Nukleotide eingebaut werden, was zu Genmutationen und Funktionsverlust führen kann (Zhang et al., 2021a). Zusätzlich wurde eine verbesserte Version des Cas12-Enzyms (dCas12) zur Genaktivierung eingesetzt. Durch die Kombination mit einem Transkriptionsaktivator können bestimmte Gene induziert und somit aktiviert werden. Diese Technologie birgt großes Potenzial für die Aktivierung von Tumorsuppressorgenen (Sultan et al., 2022).
Prime Editing ist eine neu entwickelte und äußerst leistungsfähige Genomeditierungstechnologie. Sie ermöglicht die hochpräzise Modifizierung der DNA eines Organismus (Chen und Liu, 2023). Prime Editing basiert auf der Kombination zweier Hauptkomponenten: einem modifizierten CRISPR/Cas9-Enzym und einer reversen Transkriptase. Das CRISPR/Cas9-Enzym zielt selektiv auf präzise Stellen im Genom ab, während die reverse Transkriptase die DNA an der Zielstelle umfassend modifiziert (Hassan et al., 2021). Der erste Schritt des Prime Editing-Mechanismus besteht in der Erstellung einer Primer Editing Guide-RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Diese enthält die Zielsequenz und eine RNA-Vorlage, die der gewünschten Editierungsstelle in der Ziel-DNA entspricht. Anschließend wird die pegRNA zusammen mit einer Primer Editing Nuclease (PE2) in die Zielzellen eingebracht. PE2 ist ein Fusionsprotein, bestehend aus dem Enzym Cas9, einer reversen Transkriptase und einem Primer-Editing-Adapter (Martín-Alonso et al., 2021). Innerhalb der Zelle suchen pegRNA- und PE2-Komplexe nach der spezifischen DNA, die sie modifizieren möchten. Das Enzym Cas9 schneidet die DNA und erzeugt eine Matrize aus Einzelsträngen (Choi et al., 2022). Die reverse Transkriptase nutzt diese Matrize, um die DNA für das Editing vorzubereiten. Neben der DNA-Kopie enthält die Matrize auch Anweisungen für das Editieren der RNA-Matrize. Schließlich dient der neu entstandene DNA-Strang als Matrize, um den DNA-Bruch zu reparieren. Das Ergebnis ist eine veränderte DNA-Sequenz mit der gewünschten Modifikation (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primer-Editing-Mechanismen können zu weitreichenden Mutationen in Genen führen. Sie können Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und sogar Genersatz bewirken (Anzalone et al., 2019; Chen und Liu, 2023). Prime Editing bietet gegenüber früheren Genomeditierungstechnologien mehrere Vorteile. Dazu gehören eine höhere Genauigkeit, reduzierte Off-Target-Effekte und die Möglichkeit, DNA zu editieren, ohne auf DNA-Doppelstrangbrüche angewiesen zu sein (Anzalone et al., 2020).
Die CRISPR/Cas9-Technologie wurde ursprünglich zum Schutz von Bakterien vor Plasmidübertragung und Phageninfektion entwickelt und später als effektives RNA-basiertes Werkzeug zur gezielten DNA-Manipulation für die Genomeditierung eingesetzt (Jiang und Doudna, 2017). Darüber hinaus wurde das CRISPR/Cas9-System in 50 % bzw. 87 % der bakteriellen und archaischen Genome nachgewiesen (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 ist ein potenzielles Werkzeug zur Deletion, Insertion und Korrektur beliebiger abnormaler Gensequenzen in vivo und in vitro (Sabit et al., 2021). Aufgrund seiner Spezifität für Zielgene ist CRISPR/Cas9 zudem Bestandteil des adaptiven Immunsystems (Chen und Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 besteht aus Cas9 und einer einzelnen Guide-RNA (sgRNA). Cas9 ist eine Endonuklease, die aus mehreren Proteinkomponenten zusammengesetzt ist. Darüber hinaus besitzt Cas9 einzigartige Struktur- und Konformationseigenschaften (Pacesa et al., 2022), da es aus zwei Domänen besteht: der Erkennungsdomäne (REC) und der Nukleasedomäne (NUC). Die REC-Domäne ist in drei Bereiche unterteilt: REC1, REC2 und die Brückenhelices (Cromwell et al., 2018). Die NUC-Domäne besteht aus drei Domänen: RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH und der PAM-Interaktionsdomäne (Abb. 1) (Song et al., 2016). Die sgRNA besteht aus zwei Komponenten: der CRISPR-RNA (crRNA) und der transkodierenden kleinen RNA (Tracer-RNA) (Abb. 1). Die sgRNA verbindet das Cas9-Protein mit Connexinen und bildet so einen aktiven Komplex, den sogenannten Effektorkomplex (Richter et al., 2012). Die crRNA besteht aus 18–20 Nukleotidbasenpaaren und spielt eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von Ziel-DNA-Sequenzen. Zusätzlich paart sich die crRNA mit der Ziel-DNA, und die tracrRNA dient als Gerüst für die Cas9-Nuklease, um an die Ziel-DNA zu binden (Manghwar et al., 2019). Die PAM-Sequenz besteht aus 3 Nukleotiden und bestätigt, spezifiziert und vermittelt die Bindung des Effektorkomplexes an die DNA. Die Cas9-Proteinkomplex-Untereinheiten RuvC und HNH besitzen katalytische Aktivität (Richter et al., 2012; Asmamaw und Zawdie, 2021). Die HNH-Nukleasedomäne der Cas9-Untereinheit spaltet den mit der crRNA assoziierten DNA-Strang. Die RuvC-Nukleasedomäne spaltet andere DNA-Stränge und erzeugt Doppelstrangbrüche (DSBs), woraufhin zwei verschiedene DNA-Reparaturmechanismen aktiviert werden (Jiang und Doudna, 2017) (Abbildung 1).
Abbildung 1. Übersicht des CRISPR/Cas9-Systems (A). Komponenten des CRISPR/Cas9-Systems: (i) Die Cas9-Endonuklease schneidet die Ziel-DNA-Sequenz. (ii) Eine einzelne Guide-RNA (sg-RNA) entsteht durch die Fusion von crRNA und tra-crRNA-Chimären. (a) Cas9 besteht aus mehreren Komponenten wie Rec I, Rec II, dem NUC-Lobe (HNH und Ruv C sind Unterkomponenten) und der PAM-Interaktionsdomäne (C) mit entsprechenden Funktionen. Der CRISPR/Cas9-Proteinkomplex spaltet DNA-Sequenzen in nicht-komplementäre und komplementäre Formen (D). CRISPR/Cas9 editiert das Genom in drei Schritten: Erkennung, Schneiden und Reparatur. Die designte sg-RNA führt Cas9 und erkennt die gewünschte Sequenz über die komplementäre crRNA. Cas9 erkennt die PAM-Sequenz an 5′-NGG-3′ und verschmilzt die DNA, wodurch ein DNA-RNA-Hybrid entsteht und die Spaltung aktiviert wird. Die HNH-Domäne von Cas9 spaltet den komplementären Strang, die RuvC-Domäne den nicht-komplementären. CRISPR/Cas9 repariert doppelsträngige DNA (dsDNA) auf zwei Arten: durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und homologe Rekombination (HDR). NHEJ repariert doppelsträngige DNA in Abwesenheit fremder homologer DNA enzymatisch. Dieser fehleranfällige Mechanismus kann zufällige DNA-Sequenzen einfügen oder entfernen. HDR hingegen ist sehr spezifisch und benötigt homologe DNA-Matrizen.
Zu den CRISPR/Cas9-vermittelten Reparaturmechanismen gehören die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und die homologe Rekombinationsreparatur (HDR). NHEJ ist fehleranfällig, da es Insertionen oder Deletionen beinhaltet und kein bestimmtes Reparaturmuster erfordert. Es verwendet zufällige Nukleotide zur Generierung von Standardproteinen (Abbasi et al., 2021). Dieses Reparatursystem besteht aus vier Komplexen: dem KU-Komplex, dem komplementierenden Proteinkomplex Typ 4 (XRCC-4), dem DNA-Endprozessierungsenzym und der Proteinkinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Das KU-Komplexprotein besteht aus zwei Untereinheiten, Ku70 und Ku80, und spielt eine wichtige Rolle im NHEJ-Reparaturmechanismus. Dieser wird durch die Bindung der beiden Untereinheiten (Ku70 und Ku80) an die stumpfen oder nahezu stumpfen Enden der Ziel-DNA initiiert (Abbasi et al., 2021). Die KU-Komplexproteine dienen als Gerüstproteine, um weitere NHEJ-assoziierte Faktoren an die Verletzungsstelle zu rekrutieren (Yang et al., 2020). XRCC-4 und die DNA-Ligase bestehen aus 334 bzw. 911 Aminosäuren. Der XRCC4-DNA-Ligase-IV-Komplex stimuliert die Ligation von DNA-Enden (Chatterjee et al., 2015). Das DNA-Endprozessierungsenzym, auch bekannt als Polynucleotidkinase-3′-Phosphat, ist ein Enzym, das DNA-Enden prozessiert. Es kann die 3′-Phosphatgruppe der DNA entfernen und die 5′-OH-Gruppe während der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen phosphorylieren. Dazu gehört auch die Reparatur von Einzelstrangbrüchen (SSBs) über den SSB-Reparaturweg (Chatterjee et al., 2015). Die Proteinkinase DNA-PKcs ist eine DNA-abhängige Proteinkinase, die aus einer katalytischen Untereinheit der PIKKs (Phosphatidylinositol-3-Kinase-verwandte Kinasen) und der ATM-Familie (Ataxia telangiectasia mutated) sowie ATM- und Rad3-verwandten ATRs besteht. Sie repariert Doppelstrangbrüche (DSBs) und Einzelstrangbrüche (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR ist ein präziserer und geeigneterer Reparaturmechanismus, da die Information mithilfe der intakten Form des homologen DNA-Doppelstrangs kopiert wird, obwohl hierfür Schwesterchromatiden erforderlich sind. Dieser Vorgang findet während der S/G2-Phase des Säugetierzellzyklus statt. HDR kommt hauptsächlich in Hefen vor, NHEJ ist jedoch für Säugetiere essenziell (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Der vollständige Reparaturmechanismus ist in Abbildung 1 dargestellt.
Da TNBC durch genetische und epigenetische Anomalien verursacht wird, könnte die Korrektur maligner genomischer/epigenomischer Anomalien mittels CRISPR/Cas9 ein sinnvoller Therapieansatz sein (Chen et al., 2019). Darüber hinaus weisen einige an der zellspezifischen Transkriptionsregulation beteiligte Transkriptionsfaktoren möglicherweise einzigartige Merkmale von Krebszellen auf, was darauf hindeutet, dass die Transkriptionsregulation ein vielversprechender Ansatz für die Krebstherapie sein könnte (Drost et al., 2017). Die Nutzung dieser molekularen Merkmale von Tumoren, wie genetische, epigenetische und transkriptionelle Defekte, für die Arzneimittelentwicklung kann die klinischen Ergebnisse verbessern und die Kosten für das Screening senken. CRISPR ist ein potenzielles Werkzeug zur Genomeditierung, das nicht nur krebsverursachende genomische Ziele erkennen und identifizieren, sondern auch zur Editierung, Suppression und epigenetischen Modifizierung von Onkogenen in menschlichen Zellen eingesetzt werden kann (Tabelle 1) (Ahmed et al., 2021). Es wurden bereits mehrere CRISPR-Screenings durchgeführt, um nach Genen zu suchen, die mit Tumorsuppressoren, Onkogenen und Arzneimittelresistenz assoziiert sind. Die Verwendung von CRISPR/Cas9 zur Bearbeitung verschiedener TNBC-Onkogene ist in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2. Genomeditierung verschiedener TNBC-Onkogene mittels CRISPR/Cas9 führt zu reduziertem Tumorwachstum und verminderter Metastasierung. Zu diesen Onkogenen gehören CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 und CXCR7, Crypto1, ROR1 und ST8SIA, die an der Entstehung und Metastasierung von TNBC beteiligt sind.
Die Migration, Invasion und epithelial-mesenchymale Transition (EMT) von Krebszellen sind mit ITGA9 assoziiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass ITGA9 eine Schlüsselrolle im Notch-Signalweg spielt und bei der Metastasierung von Rhabdomyosarkomen von Bedeutung ist (Molist et al., 2020). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ITGA9 eng mit der Patientenprognose bei verschiedenen Tumorarten, einschließlich Brustkrebs, zusammenhängt (Wang Z. et al., 2019). Bioinformatische Analysen von ITGA9 zeigten zudem, dass dessen Expression bei TNBC signifikant höher ist als bei anderen Brustkrebs-Subtypen. Erhöhte ITGA9-Spiegel sind mit Tumormetastasierung und Rezidiven bei TNBC-Patientinnen assoziiert. Der Knockout von ITGA9 mittels CRISPR/Cas9 führte zu Stammzell-ähnlichen Eigenschaften, Tumorangiogenese, Tumorwachstum und reduzierter Metastasierung durch Förderung des β-Catenin-Abbaus bei TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 gehört zur TGF-β-Familie und ist entscheidend für die frühe Embryogenese, die Aufrechterhaltung von Stammzellen und die Metastasierung von Krebs (Ishii et al., 2021). Auch bekannt als Tdgf-1, ist es ein onkogenes, GPI-verankertes Signalprotein, das an der Regulation der Bildung des Primitivstreifens, des Mesoderms und des Endoderms sowie an der Etablierung der Links-Rechts-Asymmetrie in der Organentwicklung während der Embryogenese beteiligt ist (Zhang et al., 2021b). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Crypto-1 als Stammzellmarker an der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) beteiligt ist (Zhang et al., 2021b). Die EMT ist nicht nur für verschiedene Prozesse wie die Embryonalentwicklung, Fibrose und Wundheilung, sondern auch für die Invasion und Metastasierung von Krebszellen von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Crypto-1 mit vier Notch-Rezeptoren interagiert und deren posttranslationale Reifung verstärkt (Brandstadter und Maillard, 2019). Der Notch-Signalweg ist bekanntermaßen an der Aufrechterhaltung menschlicher Brustkrebszellen beteiligt. Studien haben gezeigt, dass die CRISPR/Cas9-vermittelte Inaktivierung von Crypto-1 das Krebswachstum und die Metastasierung hemmt. Daher könnte Crypto-1 ein wichtiges therapeutisches Ziel für TNBC darstellen (Castro et al., 2015).
Das Protein XCL12 und seine Chemokinrezeptoren CXC (CXCR4 und CXCR7) spielen vielfältige Rollen bei der Proliferation, dem Wachstum, der Migration und der Invasion von Krebszellen (Wu et al., 2015). Diese Chemorezeptoren wurden in In-vivo- und In-vitro-Modellen über verschiedene Signalwege mit der Entwicklung von TNBC in Verbindung gebracht (Wu et al., 2015). Darüber hinaus ist die Aktivierung von CXCR4 und CXCR7 mit einer erhöhten Metastasierungsneigung und einer schlechten Prognose bei TNBC assoziiert (Karn et al., 2022). Daher könnten Knockout-Gene von CXCR4 und CXCR7 effektive Zielstrukturen für die medikamentöse Therapie von Brustkrebs, einschließlich TNBC, darstellen. Studie von Yang et al. Yang et al. (2019) verwendeten CRISPR/Cas9, um die Gene CXCR4 und CXCR7 gleichzeitig auszuschalten, und stellten fest, dass die Proliferation, das Wachstum, die Migration und die Invasion von TNBC signifikant gehemmt wurden (Yang et al., 2019).
In Brustkrebsgewebe wurden erhöhte Spiegel des Onkogens miR-3662 (TNBC) beobachtet (Yi et al., 2022). Die Herunterregulierung von miR-3662 hemmt nachweislich das Tumorwachstum und die Metastasierung von Brustkrebs sowohl in vivo als auch in vitro (Agarwal und Gupta, 2021). HBP-1 ist ein potenter Inhibitor des Wnt/β-Catenin-Signalwegs und ist wahrscheinlich für das miR-3662-vermittelte Wachstum von TNBC-Zellen verantwortlich. Kürzlich fanden Yi et al., dass die miR-3662-HBP-1-Achse den Wnt/β-Catenin-Signalweg in TNBC-Zellen reguliert (Yi et al., 2022). Aufgrund seiner tumorspezifischen Expression könnte miR-3662 ein potenzielles therapeutisches Ziel für TNBC darstellen. Daher könnte die CRISPR/Cas9-vermittelte Herunterregulierung von miR-3662 ein hervorragender Ansatz für die Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von TNBC sein.
UBR5 ist ein 300 kDa großes Nukleophosphoprotein, das als Schlüsselregulator der Tumorentstehung, Metastasierung und Immunantwort bei verschiedenen Krebsarten identifiziert wurde (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Es wurde berichtet, dass UBR5 in TNBC-Proben stark überexprimiert ist und die ERα-Funktion durch Induktion der Proliferation über seine Ubiquitin-Ligase-Aktivität stimuliert (Bolt et al., 2015). Studien zur Exomsequenzierung primärer TNBC-Proben zeigten ebenfalls eine erhöhte Expression von UBR5, was auf seine Rolle in der Entwicklung von TNBC hindeutet. Darüber hinaus führte die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion von UBR5 zu einer signifikanten Hemmung der TNBC-Metastasierung und des Wachstums in experimentellen Mausmodellen. Die Integration von UBR5 in ein Wildtyp-Mausmodell stellte dessen volle Funktionalität wieder her, während dieser Effekt in inaktivierten Mutantenstämmen nicht beobachtet wurde (Liao et al., 2017). Der Mangel an UBR5 ist bei TNBC aufgrund einer verminderten Angiogenese mit vermehrtem Zelltod (Apoptose), Nekrose und gehemmtem Tumorwachstum assoziiert. Durch den Verlust von UBR5 wird die Tumorausbreitung in entfernte Organe reduziert, und UBR5 induziert eine abnorme EMT, hauptsächlich durch die Reduktion der E-Cadherin-Expression (Zhang und Weinberg, 2018). Kürzlich wurde gezeigt, dass UBR5 aufgrund seiner fehlenden E3-Ubiquitinierungsaktivität ein wichtiger Faktor für die IFN-γ-induzierte PD-L1-Transkription bei TNBC ist. RNA-Transkriptomanalysen ergaben, dass UBR5 systemische Auswirkungen auf Gene des IFN-γ-Signalwegs haben und die PD-L1-Transaktivierung durch Erhöhung der Aktivierungsniveaus der Proteinkinase-RNA (PKR) und ihrer Signaltransduktoren und Aktivatoren STAT1 und IRF1 fördern kann. Die kombinierte Ablation der UBR5- und PD-L1-Expression mittels CRISPR/Cas9 zeigt jedoch einen synergistischen therapeutischen Effekt im Vergleich zur Blockade eines der beiden Gene allein und hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Tumormikroumgebung (Wu et al., 2022). Daher könnte CRISPR/Cas9 ein wichtiges Instrument zur Hemmung der UBR5-Funktion und damit zur Unterdrückung von TNBC-Metastasierung und Tumorwachstum sein.
ROR1 ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das während der Krebs- und Embryonalentwicklung exprimiert wird und als onkofetales Protein identifiziert wurde (Nicholas Borcherding, 2014). Das invasive Verhalten verschiedener menschlicher Krebsarten ist mit einer Hochregulation von ROR1 assoziiert. Vielversprechende Ergebnisse wurden in In-vivo- und In-vitro-Studien mit therapeutischen Substanzen erzielt, die auf ROR1 abzielen (Chien et al., 2016). Erhöhte ROR1-mRNA-Spiegel in Brustgewebeproben wurden auch mit aggressiven basalartigen Brusttumoren (BL) und deren Metastasierung in andere Körperregionen in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurde die Überexpression von ROR1 als prognostischer Marker für die Entwicklung von TNBC identifiziert (Chien et al., 2016). Die Hemmung von ROR1 mittels CRISPR/Cas9 zur Unterdrückung des Wachstums und der Metastasierung von TNBC wäre jedoch eine effektive Strategie.
Die Sialylierung ist ein Prozess, bei dem Sialinsäure an Glykokonjugate angehängt wird. Dieser Prozess wird durch Sialyltransferasen (STs) katalysiert. ST8SIA1 gehört zur ST-Familie und spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese verschiedener Erkrankungen wie lymphatischer Leukämie und Darmkrebs (Chang et al., 2018). RNA-Sequenzanalysen zeigen, dass ST8SIA1 im Brustgewebe von Patientinnen mit triple-negativem Brustkrebs (TNBC) stark exprimiert wird und positiv mit Mutationen im Tumorsuppressorgen p53 korreliert, was zur Pathogenese von TNBC beitragen könnte (Battula et al., 2017). Darüber hinaus ist ST8SIA1 an der Metastasierung und dem Rezidiv von TNBC beteiligt, was darauf hindeutet, dass es eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Entwicklung dieser Erkrankung spielt. In einem In-vitro-Modell von TNBC konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulierung von ST8SIA1 mittels CRISPR/Cas9 das Wachstum und die Metastasierung hemmt (Battula et al., 2017). Dies deutet darauf hin, dass CRISPR/Cas9 ein wichtiges Werkzeug zur Hemmung der Funktion des Onkogens ST8SIA1 bei der Behandlung von TNBC sein könnte.
NAT1 ist ein Stoffwechselenzym, das die Bildung von Phase-II-Xenobiotika katalysiert und in nahezu allen menschlichen Geweben exprimiert wird. NAT1 kann den Cofaktor Folat nutzen, um Acetyl-CoA (Acetyl-CoA) auch in Abwesenheit des aromatischen Amin-Substrats zu binden (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studien haben gezeigt, dass NAT1 die Funktion der Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9) in Brustkrebszellmodellen reguliert und vor reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei Glukosemangel schützt (Wang et al., 2018). Die Deletion von NAT1 hemmt den Pyruvatdehydrogenase-Komplex und führt zu mitochondrialer Dysfunktion (Wang L. et al., 2019). Darüber hinaus haben verschiedene Studien gezeigt, dass die Hemmung von NAT1 mittels niedermolekularer Substanzen und siRNA-vermittelter Genstilllegung die Invasivität und Proliferation von Brustkrebszellen reduzieren kann (Stepp et al., 2018). Kürzlich wurde CRISPR/Cas9 eingesetzt, um NAT1 in der Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 zu unterdrücken, was den Zellstoffwechsel in Abhängigkeit von der Expressionsstärke beeinflusste. Diese Studie zeigte auch, dass NAT-1 für die Progression und Metastasierung von TNBC entscheidend ist (Carlisle et al., 2020).
Die koordinierte Transkription von Onkogenen wird durch Super-Enhancer, Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren reguliert (Hnisz et al., 2015). Darüber hinaus ist eine Gruppe von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs), wie z. B. CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 und CDK13, für die Transkriptionsregulation erforderlich. CDK7 ist unter anderem an der Phosphorylierung der RNA-Polymerase II beteiligt, die für den Beginn und die Ausbreitung der Onkogen-Transkription in der Pathogenese von TNBC von großer Bedeutung ist. In einer wegweisenden Studie hemmte die Deletion von CDK7 mittels CRISPR/Cas9 die Entstehung von TNBC, was darauf hindeutet, dass die Pathogenese von TNBC CDK7-abhängig ist (Wang Y. et al., 2015).
Studien haben gezeigt, dass Mutationen in MYC und RBP (RNA-bindendes Protein) zu Apoptose führen können, während Einzelgenmutationen in MYC oder RBP das Wachstum von Krebszellen nicht beeinflussen (Einstein et al., 2021). Über 1000 RBPs im menschlichen Genom wurden mithilfe einer CRISPR/Cas9-basierten Bibliothek untersucht. 57 dieser RBPs erwiesen sich als entscheidend für das Wachstum von Krebszellen mit stark erhöhten MYC-Spiegeln (Wheeler et al., 2020). Darüber hinaus ist YTHDF2 wichtig für die Aufrechterhaltung des Wachstums von TNBC-Zellen und reduziert die Menge methylierter Transkripte während der intensiven Transkription und Translation in Krebszellen mit höherer MYC-Expression. YTHDF2 ist jedoch nicht essentiell für Krebszellen, die weniger auf erhöhte MYC-Spiegel angewiesen sind, um das Überleben von TNBC-Patientinnen zu verlängern (Einstein et al., 2021). Dies deutet darauf hin, dass YTHDF2 ein potenzielles therapeutisches Ziel für Medikamente sein könnte, die TNBC bekämpfen.
Zinkfingerproteine (ZNFs) machen etwa 1 % des gesamten menschlichen Genoms aus. Studien haben gezeigt, dass ZNF die Zellproliferation bei verschiedenen Krebsarten, wie Leber-, Brust- und Darmkrebs, regulieren kann (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Mithilfe von CRISPR-Knockout-Bibliotheken wurden verschiedene Tumorsuppressorgene (TSGs) in Brustkrebszellen identifiziert (Shalem et al., 2014). Eine Transkriptomstudie an CRISPR/Cas9-deletierten Brustkrebszellen mit dem Gen ZNF319 zeigte, dass ZNF319 ein Tumorsuppressorgen ist, das die Proliferation von Brustkrebszellen hemmt und somit an verschiedenen Signalmechanismen und anderen biologischen Funktionen beteiligt ist (Wang L. et al., 2022).
Ferroptose ist eine Form des programmierten Zelltods, die von Eisen abhängig ist. Es ist bekannt, dass die Entwicklung der Ferroptose durch Lipidperoxide beeinflusst wird. Darüber hinaus wurde berichtet, dass PKCβII frühzeitig Lipidperoxidation zeigt und eine erhöhte Lipidperoxidation mit Ferroptose assoziiert ist. Das Screening einer Bibliothek von CRISPR/Cas9-vermittelten Kinaseinhibitoren ergab, dass PKCβII an der Lipidperoxidation beteiligt ist, die für die Ferroptose in MDA-MB-231-Zellen entscheidend ist (Zhang et al., 2022). Dies deutet darauf hin, dass die Inaktivierung von PKCβII mittels CRISPR/Cas9 ein potenzielles Zielgen für die Behandlung von Ferroptose-assoziierten Erkrankungen darstellen könnte (Zhang et al., 2022).
Arzneimittelresistenz ist vermutlich für etwa 90 % der Todesfälle bei Krebspatienten verantwortlich und stellt eine der größten Herausforderungen in der Krebstherapie dar (Bukowski et al., 2020). Studien zeigen, dass zahlreiche Gene, die mit Arzneimittel-Efflux, DNA-Reparatur, Apoptose und verschiedenen zellulären Signalwegen in Zusammenhang stehen, mit Arzneimittelresistenz assoziiert sind (Haider et al., 2020). Einige dieser Gene wurden bereits mittels CRISPR/Cas9-Technologie gezielt verändert und zeigten vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich der Reduzierung von Arzneimittelresistenz und der Steigerung der Wirksamkeit von Krebstherapien (Vaghari-Tabari et al., 2022). Darüber hinaus wurden Hochdurchsatz-CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Screening-Bibliotheken eingesetzt, um die Funktion potenzieller Zielgene für Arzneimittelresistenz zu modifizieren (Shalem et al., 2015). Zur Identifizierung von Paclitaxel-Resistenzgenen wurde RNA-Sequenzierung in Kombination mit einem genomweiten sgRNA-Bibliotheks-Screening eingesetzt. Dabei wurden acht Kandidatengene, darunter Histon-Deacetylase 9 (HDAC9), identifiziert, die mit Arzneimittelresistenz bei Patientinnen mit rezidivierendem TNBC assoziiert sind (B et al., 2020). In einer anderen Studie wurde eine erhöhte Expression der Diserin/Threonin- und Tyrosin-Proteinkinase (DSTYK) während des Überlebens von TNBC-Patientinnen unter Antikrebstherapie beobachtet. Darüber hinaus führte die CRISPR/Cas9-vermittelte Herunterregulierung von DSTYK zu einer signifikanten Steigerung der Apoptose von arzneimittelresistenten Krebszellen in vitro (SUM102PT-Zellen und MDA-MB-468-Zellen) sowie in einem In-vivo-TNBC-Modell (Ogbu et al., 2021).
Obwohl TNBC eine abnorme Aktivierung des MAPK-Signalwegs aufweist, ist die klinische Wirksamkeit von MEK-gerichteten Therapien gering. Ein CRISPR/Cas9-Genom-Screening zeigte, dass die Hemmung von PSMG2 (Proteom-Assemblierungs-Chaperon 2) TNBC-BT549- und MB468-Zellen für den MEK-Inhibitor AZD6244 sensibilisiert. Die CRISPR/Cas9-vermittelte Herunterregulierung von PSMG2 veränderte die normale Proteasomfunktion, was zu einer Autophagie-vermittelten Disassemblierung von PDPK1 führte und dadurch die Tumorzellen in TNBC-Mausmodellen, die durch AZD6244 (MEK-Inhibitor) und MG132 (Proteasom-Inhibitor) induziert wurden, weiter verbesserte. Somit können Proteasom- und MAP-Kinase(MEK)-Inhibitoren synergistisch eingesetzt werden, um die Tumorzellproliferation zu reduzieren (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 wurde auch zur Suche nach Genfunktionsverlusten eingesetzt, die zu TNBC-Resistenzen führen (Shu et al., 2020). Ge et al. erklärten den Mechanismus der Arzneimittelresistenz von Krebszellen, die mit JQ1, einem BET-Bromodomänen-Inhibitor (BBDI), behandelt wurden. Mithilfe von CRISPR/Cas9 fanden sie heraus, dass die Deletion des rb1-Gens TNBC resistent gegen das Antikrebsmittel JQ1 macht. Daher ist die rb1-Funktion wichtig für das Ansprechen auf JQ1-Medikamente in TNBC. Sie berichteten außerdem, dass Paclitaxel ein CDK4/6-Kinase-/Mikrotubuli-Inhibitor ist und seine Kombination mit BBDIs wie JQ1 vielversprechende therapeutische Ergebnisse bei arzneimittelresistentem TNBC liefern könnte (Ge et al., 2020).
Es wurde berichtet, dass das Transkriptionsprofil langer nicht-kodierender RNA (lncRNA) für die Resistenz gegen neoadjuvante Therapien bei TNBC verantwortlich ist. Diese Studie zeigt, dass fünf verschiedene MALAT1-lncRNA-Transkripte in TNBC stark exprimiert werden. Darüber hinaus erhöhte die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion von MALAT1 die Sensitivität von TNBC-BT-549-Zellen gegenüber Paclitaxel und Doxorubicin, was auf eine mögliche Rolle von MALAT1 bei der Resistenz gegen TNBC hindeutet (Shaath et al., 2021).
Mutationen im BRCA1-Gen (BRCA1m) sind heterogen und daher schwer nachzuweisen. Die gezielte Hemmung von PARP1 (Poly(ADP-Ribose)-Polymerase), dem synthetisch-letalen Partner von BRCA1, könnte die Chemosensitivität von TNBC-Zellen gegenüber Medikamenten erhöhen. Mithilfe von CRISPR/Cas9 konnte gezeigt werden, dass die Deletion von PARP1 die Sensitivität von mBRCA1-mutierten TNBC-Zellen gegenüber Krebsmedikamenten wie Doxorubicin, Gemcitabin und Docetaxel steigert. Dies deutet darauf hin, dass PARP1 auch an der Arzneimittelresistenz bei TNBC beteiligt ist (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutationen in den Tumorsuppressorgenen BRCA1 oder BRCA2 erhöhen bekanntermaßen das Risiko, an Brustkrebs zu erkranken. Die Behandlung dieser Patientinnen erfordert den Einsatz von PARP-Inhibitoren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Deaktivierung des Nukleotid-Recyclingfaktors DNPH1 mittels CRISPR/Cas9 das toxische Nukleotid 5-Hydroxymethyldeoxyuridin (hmdU)-Monophosphat entfernen und dadurch die Sensitivität BRCA-defizienter Zellen gegenüber PARP-Inhibitoren erhöhen kann (Fugger et al., 2021). Daher könnten CRISPR/Cas9 und PARP1-Inhibitoren eine wichtige Behandlungsstrategie für TNBC darstellen.
Das Gen für das penetrante Glykoprotein (P-gp) ist ein Multiresistenzgen, das in etwa 41 % aller TNBC-Fälle überexprimiert ist (Sun et al., 2020). Der P-gp-induzierte Arzneimittel-Efflux wurde als Schlüsselregulator der Arzneimittelresistenz bei Brustkrebs identifiziert. P-gp-Inhibitoren zeigten eine erhöhte Sensitivität gegenüber Antikrebsmedikamenten bei Brustkrebs (Famta et al., 2021). Daher könnten die CRISPR/Cas9-vermittelte Ablation oder Suppression von P-gp sowie P-gp-Inhibitoren wichtige Methoden zur Überwindung der Arzneimittelresistenz bei TNBC darstellen.
Der ATP-bindende Kassetten-Transporter G2 (ABCG2) ist bekanntermaßen eine Ursache für Arzneimittelresistenz bei TNBC (Palasuberniam et al., 2015). Bislang liegen jedoch keine Berichte über den Zusammenhang zwischen der CRISPR/Cas9-vermittelten Inaktivierung von ABCG2 und der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen vor. PTEN könnte die ABCG2-Aktivierung verstärken (Palasuberniam et al., 2015; Deepak Singh et al., 2021). Daher könnte die Entfernung von ABCG2 mittels CRISPR/Cas9 in Kombination mit einem ABCG2-Inhibitor eine geeignete Behandlungsmethode zur Überwindung von Arzneimittelresistenzen bei TNBC darstellen. Tabelle 2 listet alle CRISPR/Cas9-Zielgene auf.
Tabelle 2. CRISPR/Cas9 zielt auf verschiedene TNBC-Resistenzgene ab, um Zellen für Antikrebsmedikamente zu sensibilisieren.
CRISPR/Cas9-Bibliotheken stellen ein vielversprechendes Werkzeug für das Screening von Genmutationen dar, die mit der Krebsentstehung in Zusammenhang stehen (Chan et al., 2022). Diese Screening-Methode umfasst vier Schritte: (a) Bibliothekskonstruktion, (b) lentivirale Transduktion, (c) phänotypisches Screening und (d) Zielgenanalyse. Obwohl TNBC eine abnorme Aktivierung des MAPK-Signalwegs aufweist, ist die klinische Prognose einer MEK-gerichteten Therapie für TNBC-Patientinnen mit Mutationen in Tumorsuppressorgenen wie PTEN, RB1 und TP53 sehr ungünstig.
Zusätzlich wurde mittels eines Gen-Knockout-Screenings mit CRISPR/Cas9 das potenteste und selektivste Molekül, Dehydrocatrol, das in Extrakten aus guatemaltekischen Blüten und Blättern reichlich vorkommt, getestet, um dessen Wirkung auf MDA-MB-231-Zellen zu verstehen. Dabei wurden Mechanismen der selektiven Zytotoxizität und mesenchymale Stammzelleigenschaften von TNBC-Subtypen untersucht. Dieses CRISPR/Cas9-basierte Screening zeigte außerdem, dass HSD17B11, ein Gen, das für die 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 11 kodiert, in MDA-MB-231-Zellen stark exprimiert wird und zu Dehydrofalcarinol führt, das spezifisch für diese Zellen ist (Grant et al., 2020). Dies deutet darauf hin, dass das genomische Screening mit CRISPR/Cas9 großes Potenzial für die Identifizierung der Mechanismen besitzt, die den Antikrebseigenschaften potenzieller Naturstoffe zugrunde liegen.
Darüber hinaus wurde die Anfälligkeit von TNBC für Krebs mittels eines unvoreingenommenen genomweiten In-vivo-CRISPR/Cas9-Screenings untersucht, das einen Zusammenhang zwischen onkogenen und tumorsuppressiven Signalwegen aufzeigte. Es wurde berichtet, dass Schlüsselkomponenten der mTOR- und Hippo-Signalwege eine wichtige Rolle bei der Tumorregulation in TNBC spielen. Studien haben zudem gezeigt, dass die pharmakologische Hemmung von mTORC1/2 und des Onkoproteins YAP die Pathogenität von TNBC in einem In-vitro-Wirkstoff-Matrix-Synergiemodell und in In-vivo-Patienten-Xenotransplantaten effektiv hemmt. Des Weiteren verstärkt die Torin-1-vermittelte Hemmung von mTORC1/2 die Makropinozytose, während die Verteporfin-induzierte YAP-Hemmung zum Zelltod von TNBC führt. Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse die Leistungsfähigkeit und Robustheit des genomweiten In-vivo-CRISPR-Screenings zur Identifizierung neuer und wirksamer Therapien für TNBC (Dai et al., 2021).
Eine Dysregulation des Immunsystems ist ein wichtiger Faktor bei der Tumorentstehung. Krebszellen entgehen der Immunabwehr, indem sie Abwehrmechanismen umgehen, unter anderem durch Eingriffe in die Aktivität von Immunzellen im Tumormikromilieu und durch Schwächung des Immunsystems. Daher könnte die Entwicklung eines verbesserten Immunsystems ein Schlüsselansatz im Kampf gegen Tumore sein. Die CRISPR/Cas9-basierte Genmodifikation adressiert verschiedene Aspekte der Immunfunktionsstörung aus unterschiedlichen Perspektiven. CRISPR/Cas9 wurde bereits zur Verbesserung der Antitumorimmunität gegen Brustkrebs über die folgenden Signalwege eingesetzt (Abbildung 3).
Abbildung 3. Die CRISPR/Cas9-Immuntherapie zielt auf TNBC-Zellen ab. Der Verlust von CDK5 und die Herunterregulierung von PDL1 und CD155 verstärken das Immunsystem. Ebenso erhöhen der Verlust von A2AR und die Herunterregulierung von Tumorantigenen (TAAs) wie HER2, Mucin 1 und TEM8 die Effizienz von CAR-T-Zellen bei der Abtötung von Krebszellen. CRISPR/Cas9-gesteuerte T-Zell-Screenings haben gezeigt, dass die Hemmung der p38-Kinase die Antitumoraktivität von T-Zellen verstärkt. Durch CRISPR/Cas9 modifizierte T-Zellen weisen eine erhöhte Expression des T-Zell-Rezeptors (TCR) auf, was zu einer Antitumoraktivität der T-Zellen führt.
Ziel der Immuntherapie ist es, das Immunsystem zur Bekämpfung von Krebszellen anzuregen. Die Überexpression von Immun-Checkpoint-Proteinen verhindert normalerweise Autoimmunreaktionen, kann aber Tumoren helfen, diese zu umgehen (Topalian et al., 2015). Diese Proteine hemmen Immunreaktionen durch Bindung an Rezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen. Mehrere Checkpoint-Proteine (wie CD155 und PD-L1) binden an den PD-1-Rezeptor auf Immunzellen und werden in Brustkrebs, insbesondere in TNBC (Triple-negativem Brustkrebs), exprimiert (Li Y.-C. et al., 2020). Die Herunterregulierung von PD-L1 oder seines Rezeptors mittels CRISPR/Cas9 kann das Immunsystem zur Bekämpfung von TNBC-Tumoren anregen (Yahata et al., 2019). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulierung der PD-L1-Expression durch CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion von CDK5 das Tumorwachstum in vitro und in vivo hemmt (Deng et al., 2020). Die Wachstumshemmung in In-vitro- und In-vivo-Modellen von Brustkrebs lässt vermuten, dass die shRNA-vermittelte Reduktion von CD155 einen therapeutischen Effekt auf Brustkrebs haben könnte (Gao et al., 2018).
CAR-T-Zellen exprimieren CARs, die tumorassoziierte Antigene (TAAs) erkennen und durch die Inaktivierung von Checkpoint-Proteinen ihre Aktivität steigern können (Li C. et al., 2020). Es gibt verschiedene potenzielle Zielstrukturen für die CAR-T-Zelltherapie bei Brustkrebs, darunter mehrere TAAs wie HER2, Mucin-1 und TEM8 (Bajgain et al., 2018). Es gibt Hinweise darauf, dass CAR-T-Zellen, die gegen Mesothelin (überexprimiert in TNBC BT-459-Zellen) gerichtet sind, wirksamer gegen Krebs sind, wenn PD-1 mittels CRISPR/Cas9 ausgeschaltet wird (Hu et al., 2019). Die Isolierung von T-Zellen von Patienten und deren anschließende ex-vivo-Editierung ist jedoch ein arbeits- und zeitaufwändiger Prozess. Obwohl universelle T-Zellen den Isolationsaufwand reduzieren können, sollten Spender-T-Zellen, die humane Leukozytenantigene (HLA) Klasse I und den T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimieren, entfernt werden, um Graft-versus-Host-Reaktionen zu verhindern (Ren et al., 2017; 2017a). Mithilfe von CRISPR/Cas9 kann HDR TCR und HLA gleichzeitig eliminieren und das Gen für den CAR ausschalten. Studien haben gezeigt, dass CRISPR/Cas9 verwendet werden kann, um Anti-CD19-CARs in den TCR-Locus einzuführen und so CARs effizient zu produzieren, ohne T-Zellen zu deplettieren (Dimitri et al., 2022). Multiplex-Technologien wurden entwickelt, um allogene CAR-T-Zellen zu generieren, indem gleichzeitig TCR, Beta-2-Mikroglobulin (B2M), die HLA-I-Untereinheit und andere Proteine wie PD-1 und CTLA-4 eliminiert werden, die möglicherweise stärkere Antitumor-Eigenschaften aufweisen. gegen TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Der Einsatz von CRISPR/Cas9 könnte die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen verbessern. Adenosin besitzt bekanntermaßen immunsuppressive Eigenschaften und kann die Antitumorimmunität durch Blockierung der T-Zell-Funktion und Aktivierung von Adenosin-A2A-Rezeptoren (A2AR) reduzieren (Vigano et al., 2019). Die Hemmung von A2AR mittels CRISPR/Cas9 verbesserte die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in vivo signifikant (Giuffrida et al., 2021). T-Zellen weisen verschiedene phänotypische Merkmale auf, wie z. B. Zellproliferation, Differenzierung, oxidativen und genomischen Stress. Ein CRISPR/Cas9-basiertes T-Zell-Screening zeigte die Deaktivierung von 25 verschiedenen T-Zell-Rezeptor-Kinasen. Die Deletion der p38-Kinase verstärkte die Antitumoraktivität von T-Zellen, was darauf hindeutet, dass die p38-Kinase ein wichtiger Regulator der CAR-T-Zell-Regulation ist (Gurusamy et al., 2020).
T-Zellen können mittels CRISPR/Cas9 genetisch so verändert werden, dass sie stark exprimierte TCRs produzieren. Die Übertragung genetisch veränderter T-Zellen auf Patienten zeigte eine stärkere Antitumorwirkung als endogene T-Zellen. Daher konkurrieren endogene TCRs möglicherweise mit genetisch veränderten TCRs in Patienten, was das Potenzial der Krebsimmuntherapie beeinträchtigen kann. Um dieses Problem zu lösen, könnte die Entfernung des endogenen TCR-β in Empfängerzellen mittels CRISPR/Cas9 und die anschließende Übertragung von TCR-β-T-Zellen auf Krebspatienten bessere Antitumor-Immunantworten hervorrufen, ohne dass eine Konkurrenz um endogene TCRs erforderlich ist (Fan et al. 2018). Mit Ausnahme von CRISPR-modifizierten T-Zellen sind TCRs tausendmal empfindlicher gegenüber Tumorantigenen als normale TCR-transduzierte T-Zellen. Darüber hinaus zeigen veränderte T-Zellen, die mittels γδ-TCR+-CRISPR generiert wurden, bei verschiedenen Leukämien eine höhere Expression von CD4+- und CD8+-T-Zellen als die Standard-TCR-Übertragung (Legut et al., 2018). Daher könnten modifizierte T-Zellen, die mittels CRISPR/Cas9 generiert wurden, eine wirksame Immuntherapiemethode zur Behandlung von TNBC darstellen.
Integrine sind Zelladhäsionsmoleküle, die in Zellmembranen vorkommen und die Bindung von Zellen an die extrazelluläre Matrix (ECM) fördern (Hamidi und Ivaska, 2018). Eine Fehlregulation von Integrinen ist mit der Tumorentwicklung und -migration assoziiert, da sie die extrazelluläre Matrix verändert und so das Überleben von Krebszellen im Blutkreislauf ermöglicht (Hamidi und Ivaska, 2018). Die CRISPR/Cas9-vermittelte Herunterregulierung von Integrinen verlangsamt das Tumorwachstum, die Metastasierung und die Kolonisation bei TNBC. Die Herunterregulierung von Integrin α5 (ITGA5) reduziert nachweislich die Zellmigration und -progression bei anderen Krebsarten wie Lungenkrebs (Ju et al., 2017), was darauf hindeutet, dass Integrin α5 auch ein Schlüsselfaktor in der Pathogenese von TNBC sein könnte.
Die Erzeugung von Knockout-Mäusen mit traditionellen Methoden embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) ist ein arbeitsintensiver, zeitaufwändiger und ineffizienter Prozess. Es dauert Monate und Jahre, ES-Zellen durch homologe Rekombination gezielt zu verändern, chimäre Mäuse zu züchten und diese anschließend mit heterozygoten Mäusen zu kreuzen, um homozygote Nachkommen zu erzeugen. Komplexe Kreuzungsverfahren sind erforderlich, um Mäuse mit mehreren genetischen Mutationen zu erzeugen. Bei der Verwendung von Mäusen, die durch Ablation von ES-Zellen mittels CRISPR/Cas9 oder durch Mikroinjektion von CRISPR/Cas9-Komponenten in befruchtete Einzeller-Eizellen erzeugt wurden, traten jedoch zahlreiche Probleme auf. Beispielsweise erfolgt die Einführung von Veränderungen häufig an biallelischen Loci und ist nicht genspezifisch. Kürzlich wurde berichtet, dass ES-Zellen mithilfe der CRISPR/Cas9-Technologie gleichzeitig biallelische Mutationen in bis zu fünf Gene einfügen können (Nishizono et al., 2021). Zu diesem Zweck wurden Cas9-mRNA und fünf genspezifische gRNAs gleichzeitig in ES-Zellen transfiziert. Dies unterstreicht das Potenzial und die Effektivität dieses Verfahrens, obwohl diese Mutationen möglicherweise bei der Verpaarung von Gründerlinien zur Erzeugung fünffacher Knockout-Mäuse weitergegeben wurden. Die Studie berichtet zudem über eine überraschende Entdeckung: ES-Zellen werden nicht mehr benötigt, um gentechnisch veränderte Mäuse zu erzeugen. Stattdessen wurden Cas9-mRNA und gRNA in Embryonen im Einzellstadium injiziert, um spezifische Genprodukte zu entfernen. Dadurch wurden Knockout-Gründerlinien erzeugt, die theoretisch zur Untersuchung der Folgen von Gen-Deletionen in Mäusen verwendet werden können (Qin et al., 2016). Somit ermöglicht CRISPR/Cas9 die Erzeugung transgener Mäuse zur Behandlung von TNBC zu geringeren Kosten als herkömmliche Gentechnik. Mithilfe des CRISPR/Cas-Systems wurde ein neues Knockout-Mausmodell entwickelt, das erfolgreich Punktmutationen in einem oder mehreren endogenen Genen bei TNBC einführen kann. Auf der Grundlage dieses Konzepts können auch Tiermodelle von TNBC entwickelt werden, indem BRCA1 und p53 mittels CRISPR/Cas9 deletiert werden, was zu einem Verlust der HR-Reparatur, genomischer Instabilität und mutierten Phänotypen führt ( Annunziato et al., 2020 ).
Zur Diagnose von TNBC werden derzeit verschiedene Methoden wie Mammographie, Magnetresonanztomographie (MRT) und Ultraschall eingesetzt. Diese Methoden weisen jedoch Einschränkungen auf. Die Mammographie dient der Beurteilung des lokalen Brustgewebes und nicht der Erkennung von Metastasen, bei denen Krebszellen in andere Organe gestreut haben. Die Sonographie ist für die Diagnose von TNBC nicht zuverlässig (Chen und Lee-Felker, 2023). Die MRT ist zwar sensitiver als Ultraschall und Mammographie, ihre diagnostische Genauigkeit ist jedoch begrenzt (Sha und Chen, 2022). Die Gewebebiopsie ist ein invasives Verfahren zur Identifizierung von Krebszellen. In manchen Fällen kann es jedoch vorkommen, dass bei einer Biopsie Krebsgewebe übersehen wird, wenn die Nadel vom Zielgebiet abweicht. Zudem ist sie sehr teuer und kann für die Patientin belastend sein. Da TNBC eine heterogene Krebsart ist, liefert eine Biopsie möglicherweise nicht genügend Informationen über den genauen Krebstyp. Daher besteht ein dringender Bedarf an einer neuen, diagnostisch zuverlässigen Methode zur Erkennung von TNBC. CRISPR/Cas9 könnte eine hochsensitive und minimalinvasive Alternative zur Brustkrebsdiagnostik darstellen. CRISPR/Cas9-basierte Strategien können daher zur Verbesserung von PCR-Methoden für die Diagnose von TNBC eingesetzt werden. Zunächst werden die Cas9- und cpf1-Proteine des CRISPR-Systems verwendet, um unspezifische DNA zu entfernen. Anschließend erkennen diese beiden Proteine (Cas9 und cpf1) die PAM-Sequenz, bevor sie an die Ziel-DNA binden (Deepak Singh et al., 2021). Dadurch kann die PCR Mutationen identifizieren, die mit der Krebsentstehung assoziiert sind. Mehrere Studien haben diese CRISPR-basierte Strategie zur Detektion verschiedener Mutationen in unterschiedlichen Krebsarten angewendet (Safari et al., 2019). CRISPR-basierte PCR-Methoden könnten somit die Abhängigkeit der TNBC-Diagnostik von invasiven Methoden wie der biopsiebasierten Immunhistochemie verringern.
Genotypische Veränderungen in der Hormonrezeptorregulation wurden auch bei TNBC nachgewiesen (Chen und Russo, 2009). CRISPR/Cas9-basierte PCR-Strategien mit Mikroarrays für die patientennahe Diagnostik können diese Mutationen effektiv überwachen (Hajian et al., 2019). Sie könnten medizinischem Fachpersonal zudem relevante Informationen über spezifische Mutationen bei TNBC-Patientinnen liefern und so zur Verbesserung des Therapieverlaufs beitragen. Diese kombinierte Technik weist jedoch Einschränkungen auf. Daher sind umfangreiche Forschungsarbeiten erforderlich, bevor die CRISPR/Cas-PCR-Methode in der medizinischen Versorgung zur Diagnose von TNBC eingesetzt werden kann (Yang et al., 2019).
Veröffentlichungsdatum: 14. Oktober 2024